橙皮苷-乳清蛋白基魚油納米乳液的制備及穩定性研究

劉雪梅，王兆石，劉露，陳麗麗，趙利，白春清

江西科技師范大學生命科學學院（南昌 330013）

魚油是從多脂魚類中提取的油脂，具有多種營養保健功能[1-3]，但其在貯藏過程中易發生氧化酸敗，且本身腥味重、水溶性差，因此通常采用合適的載體對其進行包埋[4-5]，而水包油型（oil-in-water，O/W）納米乳液是一種常見的包埋體系，被廣泛應用于多種活性物質的包埋保護。

研究發現，天然蛋白質的乳化功能尚佳，但其抗氧化活性有限，在實際應用中對包埋物的保護有限。周欣慧[6]以乳清蛋白和魚油制備的納米乳液在貯藏期內對于魚油的氧化保護作用不佳。因此，可使多酚與蛋白質通過共價或非共價相互作用結合，改變蛋白質構象，提高其抗氧化活性。劉潤華等[7]發現乳鐵蛋白（lactoferrin，LF）-表沒食子兒茶素沒食子酸酯（epigallocatechin gallate，EGCG）共價復合物可增強魚油乳液的物理穩定性，且在貯藏過程中抑制魚油的氧化；相似地，乳清蛋白-表沒食子兒茶素沒食子酸酯WPI-EGCG偶聯物可有效抑制魚油的降解[8]。此外，大量文獻證明多酚與蛋白質結合后，可有效提高其抗氧化能力和物理穩定性，是理想的乳化劑[9-10]。橙皮苷（hesperidin，HDN）是具有多種生物學作用的黃烷酮類多酚[11-13]，前期實驗已證實HDN與WPI的非共價結合可提高WPI的抗氧化活性[14]，但該復合物在納米乳液中對包埋物的保護作用有待進一步驗證。

試驗用魚油為模型包埋物，以HDN-WPI復合物為乳化劑制備納米乳液，研究超聲乳化法制備魚油納米乳的工藝參數，并對所得納米乳液的貯藏穩定性進行分析，以驗證HDN-WPI復合物在納米乳液體系保護魚油的可行性，為HDN-WPI復合物的進一步應用提供技術參考。

1 材料與方法

1.1 試劑材料

橙皮苷（≥95%，阿拉丁）；魚油（自制）；乳清蛋白（源葉生物）；其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

U-T6A紫外可見分光光度計（屹譜儀器制造有限公司）；FS-450超聲波處理器（上海生析超聲儀器有限公司）；SPX-100B-Z型生化培養箱（上海博迅實業有限公司醫療設備廠）；Nicomp 380微粒粒度分析儀（上海奧法美嘉公司）；Zeta電位測定儀ZetaCAD[儀思奇（北京）科技發展有限公司]；IX-71倒置熒光顯微鏡[奧林巴斯（中國）有限公司]。

1.3 試驗方法

1.3.1 HDN-WPI納米乳液的制備工藝研究

橙皮苷用去離子水配制成5 mmol/L，且用0.1 mol/L的NaOH調pH至12；乳清蛋白用磷酸緩沖液（pH7.0、10 mmol/L）配制成50 mg/mL。取5 mL橙皮苷溶液、5 mL乳清蛋白溶液于常溫反應2 h，形成HDNWPI非共價復合物，加入一定量的魚油[15]（課題組自制）和去離子水，使乳清蛋白最終濃度10 mg/mL，橙皮苷濃度1 mmol/L。在一定超聲功率和時間條件下制備納米乳液，加入0.02% NaN3溶液后4 ℃保存。

1.3.1.1 魚油體積分數的篩選

在超聲功率288 W、超聲時間6 min、乳化溫度保持在室溫的條件下制備納米乳液，考察魚油體積分數2.0%，4.0%，6.0%，8.0%，10.0%和12.0%對乳液的平均粒徑的影響。

1.3.1.2 超聲時間的篩選

在魚油體積分數6.0%、超聲功率288 W的條件下，考察超聲時間2，4，6，8，10和12 min對納米乳液平均粒徑的影響。

1.3.1.3 超聲功率的篩選

在魚油體積分數6.0%、超聲時間6 min的條件下，考察超聲功率96，192，288，384和480 W對納米乳液的平均粒徑的影響。

1.3.2 HDN-WPI納米乳液的穩定性

按照1.3.1選定的工藝制備納米乳液，將其分裝后放置于55 ℃恒溫箱中，分別測定其在不同貯藏時間（0，3，6，9，12，15和18 d）下的POV值、TBARS值、粒徑、Zeta電位及微觀形態，同時設定WPI基納米乳液、魚油樣品為對照，評價HDN-WPI納米乳液的穩定性。

1.3.3 物化指標的測定

1.3.3.1 外觀形態觀察

在相應的貯藏期內對乳液外觀進行拍照，觀察乳液分層情況。

1.3.3.2 平均粒徑和Zeta電位的測定

納米乳液用磷酸緩沖液（pH7.0，10 mmol/L）稀釋100倍，測量粒徑、Zeta電位。

1.3.3.3 過氧化值的測定

按照Katsuda等[16]的方法進行測定。取1.5 mL異辛烷-異丙醇（3∶1，V/V）混合液，加入0.3 mL乳液，渦旋10 s，20 s后再次渦旋，重復3次，以3000 r/min離心2 min。移取200 μL上層透明有機相至2.8 mL甲醇-丁醇（2∶1，V/V）中，另加入30 μL NH4SCN與FeCl2（1∶1，V/V）混合液。靜置20 min，測510 nm處的吸光度，并按照苯氫過氧化物繪制的標準曲線計算過氧化值。

1.3.3.4 丙二醛生成量的測定

根據Zhu等[17]的方法并進行適當修改。將0.188 g TBA、0.88 mL 12 mol/L HCl、41.4 g H2O、7.5 g TCA混合，配成硫代巴比妥酸溶液。將2.0 mL硫代巴比妥酸溶液與1.0 mL納米乳液混合，于75 ℃恒溫水浴15 min，至顏色變為粉紅色。冷卻至室溫后于4000 r/min離心15 min，濾紙過濾后取1 mL溶液，加入3 mL去離子水混勻，于532 nm測其吸光度。并參照1,1,3,3-四乙氧基丙烷為外標繪制的標準曲線計算丙二醛含量。

1.3.3.5 乳液微觀形態的觀察

用磷酸緩沖液將乳液稀釋100倍，取200 μL稀釋乳液、200 μL緩沖液和20 μL尼羅紅溶液（50 mg/mL）混合，渦旋4 min使其充分染色。滴一滴于載玻片中央，蓋上蓋玻片，用倒置熒光顯微鏡觀察并拍照。

1.3.4 數據統計與處理

所有試驗重復進行3次，采用Origin 2019繪圖，IBM SPSS Statistics 26軟件方差分析（ANOVA），鄧氏多重檢驗比較差異顯著性，顯著水平為p＜0.05。

2 結果與分析

2.1 HDN-WPI納米乳液的制備工藝研究

2.1.1 魚油體積分數對納米乳液粒徑的影響

由圖1和圖2可發現，隨著魚油體積分數增大，乳液平均粒徑呈先降低后增大趨勢，并伴隨粒徑分布范圍先變窄后變寬。魚油體積分數為6.0%時，平均粒徑達到最小值，且粒徑主要分布在200～600 nm范圍內。魚油體積較低（2.0%）時，可能乳化劑處于過量狀態，在超聲的驅動下，過量的HDN-WPI不僅能在魚油表面形成緊密的界面膜，過多的乳化劑分子還可能吸附在油水界面上，導致粒徑增大[18]。并且在這種高乳化劑濃度體系下存在排空力，導致乳液出現聚集，大顆粒增多[19]。隨著魚油添加量提升，HDN-WPI均勻吸附在魚油表面，并形成均一粒徑較小的乳液，而較高魚油添加量時粒徑的增大可能是因為一定濃度的乳化劑只能穩定有限的油水界面，隨著油組分增加，需要通過降低總界面面積以實現所有油滴表面的充分覆蓋，導致形成較大的乳狀液滴[20]。

圖1 魚油體積分數對納米乳液平均粒徑的影響

圖2 魚油體積分數對納米乳液粒徑分布的影響

2.1.2 超聲時間對納米乳液平均粒徑的影響

由圖3和圖4可知，隨著超聲時間延長，納米乳液的平均粒徑逐漸降低，并在6～10 min內基本保持恒定，后略有升高，而粒徑分布范圍在隨著超聲時間延長變窄后，不斷變寬，并在超聲時間6 min時，呈現最窄的粒徑分布。

圖3 超聲時間對納米乳液平均粒徑的影響

圖4 不同超聲時間下納米乳的粒徑分布圖

試驗中超聲乳化是重要的能量輸入方式，魚油在超聲波中界面變得不穩定，并以液滴的形式噴射到水相中，形成大小不均一的液滴。在超聲空化效應引起的流體混合和強剪切力作用下，將分散形成的初級液滴裂解為亞微米及液滴。在超聲前期，由于處理時間不夠，形成的初級液滴較多，粒徑大且分布不均一，而隨著時間延長，初級液滴逐漸被分解，并產生較多亞微米級液滴，粒徑變得均一。過長時間的處理引起的熱效應可能引起WPI變性，從而導致乳液聚集，產生不穩定的液滴。

2.1.3 超聲功率對納米乳液平均粒徑的影響

由圖5可知，超聲功率由96 W增大到288 W時，HDN-WPI基納米乳液平均粒徑逐漸降低，說明超聲過程中原溶液中的一些較大顆粒物質被高度破碎。超聲功率由288 W增大到480 W時，乳液的平均粒徑緩慢增加。有研究表明超聲處理可有效降低乳液的粒徑大小，且超聲功率越大，強度越大，相同時間下，產生的粒子越小，但過度的超聲處理，可能會使得小液滴重新聚集成大液滴，微粒與微粒之間相互吸引，產生過處理效應[21]。超聲處理會使蛋白質結構展開，暴露出更多的疏水基團，促進蛋白質之間的疏水相互作用，從而有助于形成更小的液滴[22-23]。此外，HDNWPI的相互作用方式主要為疏水相互作用[14]，因此橙皮苷分子可能具有將水分子從蛋白質表面排出的能力，以促進相鄰未折疊蛋白之間的疏水相互作用，從而降低蛋白質聚集的活化能壘，在適宜超聲強度的協同作用下，提高超聲功率可產生粒徑小且均一的粒子，此結果與Li等[24]相關研究基本一致。但是過量的超聲功率會破壞分子間非共價相互作用，弱化HDN對WPI乳液的穩定作用，導致超聲功率提高，粒徑有所增加[20]。

圖5 超聲功率對納米乳液平均粒徑的影響

2.2 HDN-WPI納米乳液的穩定性

2.2.1 外觀形態觀察

試驗同時制備了WPI穩定的納米乳，作為對照。由圖6可發現HDN-WPI基納米乳液在18 d內未出現明顯的分層現象，但顏色由原來的白色逐漸變為暗黃色，推測這可能是由于乳液在貯藏過程中油脂被氧化生成醛類、酮類、氧化物和過氧化物等化學物質，導致顏色逐漸變黃，而新制備WPI基納米乳液呈乳白色，但在第3天時出現明顯的分層現象，且隨著天數增加，上層固形物高度也逐漸增加，下層乳液逐漸變透明，分散體系越來越不均一，渦旋后可觀察到明顯的較大顆粒。這說明WPI基納米乳液的物理穩定性極差，不適于用于魚油納米乳液的制備，因此后續測量意義不大。故在貯藏期間，未對WPI基納米乳液的相關參數進行測量分析。研究重點放于HDN-WPI基納米乳液的穩定性及其對魚油的氧化保護。

圖6 貯藏期間乳液外觀形態觀察

2.2.2 乳液微觀形態觀察與粒徑分析

由圖7可發現，新制備（0 d）的WPI基、HDNWPI基納米乳液皆分散均勻，但前者的平均粒徑（557.8 nm）明顯大于后者（223.0 nm）。HDN-WPI基納米乳液在整個貯藏過程中粒徑沒有顯著性變化，貯藏結束時，平均粒徑為229.47 nm，且分布均勻。

圖7 HDN-WPI與WPI穩定的納米乳液微觀形態與粒徑分布圖

2.2.3 乳液電位分析

由圖8可知，第0～第9天，Zeta電位值隨著時間的增加由-21.35 mV降至-32.95 mV，說明這段時間內吸附在分散相表面的蛋白質分子所帶的負電荷逐漸增加，這可能是由于魚油氧化酸敗產生的游離脂肪酸吸附在其表面所致。第18天時Zeta電位值略有降低，但與第9天之間未存在顯著性差異。

圖8 HDN-WPI基納米乳液Zeta在貯藏期間的變化

2.2.4 POV值的測定

由圖9可知，在0～12 d內，脂質過氧化物的含量在HDN-WPI納米乳液和魚油貯藏過程中均整體呈現緩慢上升趨勢，在12～18 d內，脂質過氧化物含量在HDN-WPI納米乳液和魚油貯藏過程中均整體呈現緩慢下降。前期，過氧化值升高說明體系產生一定量過氧化物，而后期數值的降低可能源于部分過氧化物分解生成更高級的次級氧化物。但在整個貯藏過程中，HDN-WPI納米乳液中的測定值都顯著低于魚油樣品中的測定值，說明HDN-WPI作為乳化劑可以在一定程度上延緩魚油的氧化。

圖9 乳液與魚油在55 ℃貯藏18 d過程中過氧化物含量的變化

2.2.5 TBARS值測定

為進一步監測氧化進程，此次研究監測樣品在55 ℃的次級氧化產物的變化。由圖10可知，在18 d的貯藏期內，乳液與魚油中丙二醛的含量均呈現整體上升趨勢，其中魚油樣品丙二醛中的增值速度較快，而HDN-WPI納米乳中在12 d前基本不變，后期略有升高，這與POV測定值基本呼應。由此可見，HDN-WPI作為乳化劑可以有效降低魚油中丙二醛的生成量，即可以有效保護魚油被氧化。這可能是因為HDN-WPI在魚油表面構成了致密的界面膜，可在一定程度上屏蔽氧分子的轉移，從而抑制油脂氧化。此外，HDN的加入通過清除自由基阻礙過氧化鏈反應的發生，從而有效地抵抗脂質的次級氧化。

圖10 魚油與HDN-WPI基納米乳在55 ℃貯藏18 d過程中TBARS值變化趨勢圖

3 結論

研究超聲乳化法制備HDN-WPI基魚油納米乳的工藝，該方法在魚油體積分數6%、超聲功率288 W、超聲時間6 min下可獲得均一的納米乳液。HDN-WPI基納米乳液物理穩定性明顯優于WPI基納米乳液，且可以有效減緩魚油中過氧化物、丙二醛的生成量。試驗表明HDN-WPI非共價相互作用復合物作為納米乳液乳化劑可為魚油提供較強的氧化保護作用。