龍葵果多酚物質(zhì)響應(yīng)面提取工藝優(yōu)化及抗氧化分析

石艷賓，耿璐,2，趙雅雯，黃登禹*

1. 天津天獅學(xué)院（天津 301700）；2. 天津農(nóng)學(xué)院（天津 300380）

龍葵果是植物龍葵（Solanum nigrumL.）的成熟果實[1]，屬于茄科（Solanaceace），又名天茄子、野葡萄、黑天天、苦葵等，具有很高的營養(yǎng)價值和醫(yī)療保健作用[2]。龍葵果作為野生資源，成為新興食品工業(yè)的一種重要原料，來生產(chǎn)龍葵果保健飲料、果醬、果酒、罐頭等[3-4]。植物多酚享有“健康衛(wèi)士”的美譽[5-6]，具有抗腫瘤、抗氧化、防治冠心病與中風(fēng)等心腦血管疾病等作用，屬于植物組織中一大類化合物。多酚類物質(zhì)中的R·OH基，能形成氫自由基（H·），以消除羥自由基（OH·）和超氧陰離子（O2-）等自由基的活性，起到保護組織免受氧化危害的作用，在抗氧化[7]、抑菌、抗病毒、調(diào)血脂、降血糖[8]等方面都有很好的成效。Wang等[9]篩選龍葵中的淀粉酶抑制劑，分析龍葵多酚物質(zhì)抗癌細胞作用，指出龍葵多酚物質(zhì)具有抗氧化、抗腫瘤、抗糖尿病和抗增殖作用等多種活性。陳鳳清等[10]研究指出龍葵果實中的多種抗氧化酶能及時清除體內(nèi)有氧代謝產(chǎn)生的活性氧等毒害物質(zhì)，與其他功能物質(zhì)組成的抗氧化系統(tǒng)，對機體具有保護作用。從野生資源開發(fā)利用角度出發(fā)，優(yōu)化龍葵果多酚提取工藝，分析多酚物質(zhì)的抗氧化性能，為龍葵果的綜合開發(fā)利用及龍葵果多酚物質(zhì)的工業(yè)化生產(chǎn)提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

曬干龍葵果（市售）；無水乙醇（分析純，天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司）；無水碳酸鈉（分析純，天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司）；沒食子酸標(biāo)準品（中國生物制品檢定所）；福林酚試劑（生物制劑，上海麥克林生化科技有限公司）。

1.2 儀器與設(shè)備

AR124CN電子分析天平（上海精密科學(xué)儀器有限公司）；SB3200DTDN超聲波清洗機（寧波新芝生物科技股份有限公司）；DT5-6B低速自動平衡離心機（北京時代北利離心機有限公司）；FW-80高速萬能粉碎機（上海科恒實業(yè)發(fā)展有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 沒食子酸標(biāo)準曲線制作

沒食子酸母液的配制。精確稱取0.1167 g沒食子酸標(biāo)準品，用蒸餾水定容至100 mL，形成沒食子酸儲備液。分別吸取1，2，3，4和5 mL沒食子酸儲備液，用蒸餾水定容至100 mL容量瓶中制成一系列濃度梯度的沒食子酸工作液。各吸取1 mL工作液分別加入25 mL具塞比色管中，加5 mL 10%福林酚溶液，靜置5 min后加4 mL 7.5%碳酸鈉溶液，用蒸餾水定容后靜置1 h，在765 nm處測量吸光度。

1.3.2 試驗方法

1.3.2.1 多酚物質(zhì)提取

按照陳佳佳等[11]方法粉碎制備龍葵果待測樣品。稱取1 g龍葵果粉末，按照一定超聲功率、料液比加入不同體積分數(shù)的乙醇溶液進行超聲輔助浸提[12]，定容至50 mL。將提取多酚溶液在轉(zhuǎn)速4000 r/min條件下離心20 min，制備上清液待測。

1.3.2.2 多酚測定

采用福林酚比色法[13]。取1 mL待測樣品溶液于比色管中，加入5 mL 10%福林酚，反應(yīng)3～8 min內(nèi)加入4 mL 7.5% Na2CO3溶液，定容至25 mL，用1 mL蒸餾水作為空白對照，1 h后在765 nm處測量其吸光度。多酚得率[14]按式（1）計算。

式中：Y為多酚得率，%；C為多酚質(zhì)量濃度，mg/mL；V為提取樣品溶液總體積，mL；N為稀釋倍數(shù)；m為龍葵果質(zhì)量，g。

1.3.3 單因素試驗

在料液比1∶30 g/mL、乙醇體積分數(shù)60%、超聲時間25 min、提取溫度30 ℃條件下，研究超聲功率（超聲波清洗機功率180 W）對多酚得率的影響。超聲功率范圍60%，70%，80%，90%和100%，分析得到最優(yōu)超聲功率較優(yōu)水平后，逐個分析乙醇體積分數(shù)40%～90%（每個水平間隔10%）、超聲提取時間20～45 min（每個水平間隔5 min）、提取溫度30～80 ℃（每個水平間隔10 ℃）對龍葵果多酚物質(zhì)得率的影響，確定超聲功率、超聲時間、提取溫度的最優(yōu)水平。

1.3.4 響應(yīng)面試驗

根據(jù)Box-Behnken中心組合試驗設(shè)計原理，在單因素分析的基礎(chǔ)上，優(yōu)化超聲波輔助提取龍葵果多酚的工藝條件。以龍葵果多酚得率Y為響應(yīng)值，乙醇體積分數(shù)、超聲功率、超聲提取溫度、超聲提取時間為試驗因素，設(shè)計出四因素三水平的29組試驗（中心點試驗重復(fù)5次），設(shè)計因素水平及參數(shù)見表1。

表1 Box-Behnken試驗設(shè)計因素水平編碼表

1.3.5 多酚物質(zhì)抗氧化能力測定

以VC為對照，根據(jù)表2將龍葵果多酚提取液、VC溶液配制成10～100 μg/mL濃度的樣品溶液，按照表3、式（2）進行DPPH自由基清除能力測定。

表2 樣品或VC系列濃度溶液配制

表3 樣品溶液DPPH測定方法

2 結(jié)果與分析

2.1 沒食子酸標(biāo)準曲線

以沒食子酸標(biāo)準溶液為橫坐標(biāo)，吸光度作為縱坐標(biāo)，得到標(biāo)準曲線。回歸方程為y=0.149 8x+0.013 4，R2=0.994 7。

2.2 多酚提取工藝優(yōu)化

2.2.1 單因素試驗

2.2.1.1 超聲功率對多酚得率的影響

依據(jù)試驗方法1.3.2稱取龍葵果粉末，固定料液比1∶30（g/mL）、提取溫度30 ℃、乙醇體積分數(shù)60%、超聲浸提25 min，超聲功率對龍葵果多酚得率的影響見圖2。隨著超聲功率增加，龍葵果多酚得率先提高而后下降，超聲功率達到90%時，多酚化合物含量最高，此時多酚得率為19.08%。隨著超聲功率增強，超聲波振蕩加強，樣品細胞壁被破壞，多酚的溶出量增加，溶劑進入固體樣品內(nèi)部。超聲功率為90%時，多酚基本溶出，繼續(xù)增加超聲功率，多酚結(jié)構(gòu)被破壞，溶出雜質(zhì)增多，降低超聲功率使得溶出多酚不足，龍葵果多酚得率反而降低，因此多酚超聲功率90%時最優(yōu)。

圖2 超聲功率對多酚得率的影響

2.2.1.2 乙醇體積分數(shù)對多酚得率的影響

依據(jù)試驗方法1.3.2稱取龍葵果粉末，固定料液比1∶30（g/mL）、溫度30 ℃、超聲功率90%、超聲輔助浸提25 min，龍葵果多酚得率受乙醇體積分數(shù)的影響見圖3。乙醇體積分數(shù)增加導(dǎo)致龍葵果多酚得率先提高后下降，乙醇體積分數(shù)50%時，多酚化合物含量最高，此時多酚得率為19.06 μg/mL。其原因可能是乙醇體積分數(shù)大于50%之后越增大，多酚醇溶性越低，從而導(dǎo)致多酚得率下降，故乙醇體積分數(shù)50%時最優(yōu)。

圖3 乙醇體積分數(shù)對多酚得率的影響

2.2.1.3 超聲時間對多酚得率的影響

依據(jù)試驗方法1.3.2稱取龍葵果粉末，在料液比1∶30（g/mL）、乙醇體積分數(shù)50%、提取溫度30 ℃、超聲功率90%條件下進行超聲輔助提取，龍葵果多酚得率受超聲時間的影響見圖4。隨著超聲時間增加，龍葵果多酚得率逐漸升高，提取時間30 min時，龍葵果多酚得率最高，此時多酚得率為20.74%。因為多酚溶出量隨著時間增加而增加，但是超聲時間達到30 min時，多酚大部分已溶出；延長超聲時間對多酚得率影響不大[15]，反而會使多酚不穩(wěn)定。因為機械波和熱效應(yīng)的影響，多酚被分解或氧化成其他物質(zhì)，使得得率降低，因此超聲時間30 min時最優(yōu)。

圖4 超聲時間對多酚得率的影響

2.2.1.4 超聲溫度對多酚得率的影響

依據(jù)試驗方法1.3.2稱取龍葵果粉末，在料液比1∶30（g/mL）、乙醇體積分數(shù)50%、超聲功率90%、超聲時間30 min條件下進行超聲輔助提取。由圖5可知，隨著超聲溫度增加，龍葵果多酚得率出現(xiàn)先上升后下降再趨于平緩趨勢。超聲溫度60 ℃時，龍葵果中多酚得率最高，此時多酚得率為19.38%。因為分子運動隨著超聲溫度增加而增強，龍葵果粉末與乙醇重復(fù)接觸利于多酚溶出，超聲溫度到達60 ℃時，大部分多酚溶出，繼續(xù)升溫使多酚分解氧化，會使溶劑大量揮發(fā)，從而使多酚得率降低[16]，因此超聲溫度60 ℃時較優(yōu)。

圖5 超聲溫度對多酚得率的影響

2.2.2 響應(yīng)面試驗結(jié)果與分析

2.2.2.1 響應(yīng)面試驗設(shè)計與結(jié)果

根據(jù)單因素試驗結(jié)果，選取乙醇體積分數(shù)、超聲功率、超聲溫度和超聲時間作為考察因素，進行響應(yīng)面試驗，試驗結(jié)果詳見表4。

表4 Box-Behnken試驗設(shè)計與結(jié)果

2.2.2.2 響應(yīng)面試驗結(jié)果方差分析

根據(jù)表4響應(yīng)面試驗結(jié)果進行回歸模型方差分析，詳見表5。

由表5可知，因素A、B、C、D，交互性AB、BD、CD，平方項A2、B2、C2、D2的p值均小于0.01，表明A、B、C、D因素及交互項AB、BD、CD對龍葵果多酚得率的影響非常顯著。交互項AC、BC的p值小于0.05，對多酚得率的影響顯著。根據(jù)表5中的F值，四個因素影響的大小順序依次是C＞D＞B＞A，即超聲功率＞乙醇體積分數(shù)＞超聲溫度＞超聲時間。

表5 回歸模型方差與分析

2.2.3 響應(yīng)曲面圖分析

兩因素之間交互作用見響應(yīng)面圖6～圖11。響應(yīng)面圖均開口向下，說明響應(yīng)面值具有峰值，并表明其隨著因素增大而增大。龍葵果多酚得率受各因素影響越大，響應(yīng)面圖越為陡峭，響應(yīng)面圖越平緩影響越小。各因素之間的交互作用均較大，超聲功率與乙醇體積分數(shù)之間交互作用不如其他交互作用的影響顯著。

圖1 沒食子酸標(biāo)準曲線圖

圖6 超聲時間和超聲溫度對多酚得率的影響

圖7 超聲時間和乙醇體積分數(shù)對多酚得率的影響

圖11 超聲功率和乙醇體積分數(shù)對多酚得率的影響

圖8 超聲時間和超聲功率對多酚得率的影響

圖9 超聲功率和超聲溫度對多酚得率的影響

圖10 超聲溫度和乙醇體積分數(shù)對多酚得率的影響

2.2.4 驗證試驗

龍葵果多酚超聲波輔助提取工藝利用響應(yīng)面建立的模型優(yōu)化參數(shù)，得到最優(yōu)工藝條件：超聲時間28.97 min、超聲溫度50.63 ℃、超聲功率82.66%、乙醇體積分數(shù)50%，在此條件下多酚提取量預(yù)測值為20.27%。為便于實施，實際試驗值修正為超聲時間29 min、超聲溫度50 ℃、超聲功率83%、乙醇體積分數(shù)50%，實際龍葵果多酚得率為20.48%，試驗結(jié)果與模型符合良好，說明該模型能較好反映龍葵果多酚提取得率。

2.2.5 抗氧化性分析

2.2.5.1 VC對DPPH自由基清除能力分析

由圖12可知，隨著VC濃度增大，VC對DPPH自由基清除率隨著濃度增大上升而后趨于平緩的趨勢。VC濃度≤70 μg/mL時，VC清除DPPH自由基的能力隨VC濃度增大而明顯增大。擬合得到回歸方程y= -0.010 1x2+1.777 0x+10.788 3，R2=0.966 4。根據(jù)回歸方程計算VC半數(shù)清除率，IC50=25.87 μg/mL。

圖12 VC濃度-清除率關(guān)系曲線

2.2.5.2 龍葵果多酚提取液對DPPH自由基清除能力分析

按照響應(yīng)面優(yōu)化提取條件制備龍葵果多酚提取液的質(zhì)量濃度為98.96 μg/mL，依據(jù)試驗方法1.3.2測定龍葵果多酚物質(zhì)的DPPH自由基清除率。以多酚樣液質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，清除率為縱坐標(biāo)，得到圖13龍葵果多酚濃度與DPPH·清除率關(guān)系曲線。隨著樣品濃度增大，多酚樣品對DPPH自由基清除率先增大后趨于平緩。樣品濃度大于80 μg/mL時，清除DPPH自由基的能力隨樣品濃度增大而增加緩慢。擬合得到回歸方程y=-0.0101x2+1.7770x+10.7883，R2=0.9664。根據(jù)回歸方程計算得到龍葵果多酚的半數(shù)清除率，IC50=22.76 μg/mL。龍葵果多酚的半數(shù)清除率IC50小于VC的半數(shù)清除率，說明其抗氧化效果比VC更強。

圖13 樣品多酚濃度-清除率關(guān)系曲線

3 結(jié)論

龍葵果營養(yǎng)豐富，且含有抗氧化、抗腫瘤、抗糖尿病作用等多種活性成分，成為新興食品工業(yè)的一種重要原料。以龍葵果原料，選取乙醇為提取溶劑，采用超聲輔助提取方式提取龍葵果中的多酚物質(zhì)。對多酚提取得率影響因素主次順序為超聲功率、乙醇體積分數(shù)、超聲溫度、超聲時間，且對多酚得率的影響非常顯著，交互項AB、BD、CD對龍葵果多酚得率的影響非常顯著，交互項AC、BC對龍葵果多酚得率的影響顯著。優(yōu)化工藝條件為超聲時間28.97 min、超聲溫度50.63 ℃、超聲功率82.66%、乙醇體積分數(shù)50%，龍葵果多酚得率為20.48%，試驗結(jié)果與模型符合良好。龍葵果多酚的DPPH自由基半數(shù)清除率為22.76 μg/mL，低于VC的半數(shù)清除率，表明龍葵果多酚具有較強的抗氧化性。龍葵果多酚物質(zhì)提取與抗氧化試驗，將進一步研究多種提取方式協(xié)同提取，分析龍葵果多酚物質(zhì)與其他抗氧化劑的協(xié)同作用，為天然復(fù)配食品添加劑發(fā)展提供參考。