豬肉中幾種磺胺類藥物測定的探討和改進

余杰，唐勇，周書來，宋建群，應樺

1. 樂山職業技術學院（樂山 614000）；2. 樂山豐野農業科技有限責任公司（樂山 614000）

磺胺類藥物是指一類具有對氨基苯磺酰胺結構的藥物總稱，如磺胺嘧啶、磺胺地索辛、磺胺喹惡啉等。作為抗菌類藥物，因其具有高效、價格低廉等優點，被廣泛應用于畜牧業或動物疾病的治療。長期食用磺胺類藥物超標的動物源性食品，可能引發泌尿系統、肝臟損傷，過量的攝入更極有可能致癌[1-2]。因此，世界各國都對該類藥物在畜禽肉中的殘留制定了嚴格的限量[3]。目前磺胺類藥物的測定分析方法有酶聯免疫吸附法[4]、氣相色譜法[5]、氣相色譜-質譜聯用法[6]、液相色譜法[7]、液相色譜-串聯質譜法[1-3,8-11]等。液相色譜-串聯質譜法測定復雜基質時具有靈敏度高、選擇性好、分析效率高等優點[8-9]，因此該方法被廣泛應用于動物組織中磺胺類藥物的測定。農業部1025號公告-23-2008[10]實現了對磺胺類藥物的提取和凈化，但是仍存在有待改進之處，如：采取旋轉蒸發法去除乙酸乙酯，不僅效率較低，且存在爆沸的現象；對樣品的提取不完全；加入正己烷去脂時未考慮殘留正己烷對前處理小柱的影響；只采用了甲醇稀釋制備成系列濃度的磺胺標準工作曲線液來做標準曲線，忽略了基質效應對磺胺類藥物的影響等問題。結合實際情況，對農業部1025號公告-23-2008試驗方法做進一步的優化和改進，以提升試驗效率及準確度。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

DGU-20A-API3200超高效液相色譜串聯質譜儀（AB SCIEX公司）；FA124電子天平（上海舜宇恒平科學儀器有限公司）；UPT-Ⅱ-10T超純水機（四川優普超純科技有限公司）；HSC-B氮吹儀（天津市恒奧科技發展有限公司）；VM24位固相萃取柱（天津艾杰爾科技有限公司）；TGL-16高速離心機（四川蜀科儀器有限公司）；SHA-B水浴恒溫振蕩器（常州冠軍儀器制造有限公司）；KQ700數控超聲波清洗機（昆山市超聲儀器制造有限公司）。

乙酸乙酯、正己烷、甲醇、乙腈、甲酸均為色譜純；鹽酸、氨水均為分析純；試驗用水均為超純水。

7種磺胺類藥標準品：磺胺甲基嘧啶（純度99.2%，lot：C0008380，曼哈格）；磺胺甲惡唑（純度97.8%，lot：C0005164，曼哈格）；磺胺間甲氧嘧啶（純度97.0%，lot：C0005432，曼哈格）；磺胺二甲嘧啶[純度99.4%，lot：G136653，Dr.Ehrenstorer GmbH（德國）]；磺胺地索辛[純度99.4%，lot：G122608，Dr.Ehrenstorer GmbH（德國）]；磺胺喹惡啉[純度98.92%，lot：G159519，Dr.Ehrenstorer GmbH（德國）]；磺胺嘧啶[純度99.2%，lot：G140186，Dr.Ehrenstorer GmbH（德國）]。

1.2 配制

鹽酸溶液（0.1 mol/L）：量取4.15 mL濃鹽酸，用水定容至500 mL。

磺胺類藥物標準儲備液（1 000 μg/mL）：分別準確稱取適量的磺胺類藥物標準品，用甲醇溶解定容，配制成1 000 μg/mL的標準貯備液，在-20 ℃冰箱中保存。

磺胺類混合標準中間液（1 μg/mL）：精密量取上述標準貯備液（1000 μg/mL）各10 μ，置10 mL容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，在4 ℃冰箱中保存。

1.3 儀器工作條件

1.3.1 色譜條件

流動相A相為0.1%甲酸乙腈，流動相B相為0.1%甲酸，流速為0.30 mL/min，梯度洗脫條件見表1。

表1 液相色譜梯度洗脫條件

1.3.2 質譜條件

掃描模式：電噴霧正離子（ESI+）。TEM：450 ℃；CUR：30 psi；CAD：5 psi；IS：4 500 V；GS1：30 psi；GS2：30 psi。Q1和Q3均為單位分辨率。

1.4 試驗方法

1.4.1 標準曲線的配制

磺胺類混合標準工作液：分別量取適量的磺胺混合標準中間液，用甲醇稀釋成質量濃度為5.0，10.0，20.0，40.0，80.0和100.0 ng/mL的標準工作液。

基質配標工作曲線的制備：稱取5 g與試樣基質相應的陰性樣品，經1.4.2小節提取和凈化，制成空白基質溶液。分別取適量磺胺類混合標準中間液，用空白基質溶液配成質量濃度為5.0，10.0，20.0，40.0，80.0和100.0 ng/mL標準工作液。

隨行加標工作曲線的制備：稱取5 g與試樣基質相應的陰性樣品，加入系列適量磺胺標準中間液，經1.4.2小節提取和凈化，配成質量濃度為5.0，10.0，20.0，40.0，80.0和100.0 ng/mL標準工作液。

表2 七種磺胺類藥物的質譜分析參數

1.4.2 樣品提取與凈化

提取：稱取5 g試樣，置于50 mL離心管中，加入15 mL乙酸乙酯，在水浴恒溫振蕩器振蕩5 min，再超聲提取10 min，按5000 r/min離心10 min，分離上清液于125 mL分液漏斗中，殘渣用同樣方法重復提取1次，合并乙酸乙酯層。

凈化：在上述125 mL分液漏斗中加入5 mL 0.1 mol/L鹽酸，充分振蕩分液漏斗后靜置，待分層后收集下層溶液于另一50 mL離心管中，再分2次用2 mL 0.1 mol/L的鹽酸洗滌分液漏斗并再次充分振蕩，靜置分層，合并鹽酸層溶液。在含有鹽酸的50 mL離心管中加入5 mL正己烷，渦旋振蕩1 min后按10000 r/min離心5 min，吸去上層正己烷，再用3 mL的正己烷重復1次，最后用氮吹將液面殘留正己烷吹干，取下層液備用。

經農業部1025號公告-23-2008凈化步驟中過柱操作對上述備用液進行過柱，收集洗脫液于45 ℃水浴氮氣吹干，用水定容至1 mL，過0.2 μm有機濾膜，供液相色譜-串聯質譜儀測定。

2 結果與分析

2.1 提取過程

農業部1025號公告-23-2008規定，加入15 mL乙酸乙酯，采用渦旋2 min進行提取，試驗發現回收率較低。主要原因是僅使用渦旋2 min的方式進行提取操作，目標化合物提取不充分，導致回收率較低。改用加入15 mL乙酸乙酯后水浴恒溫振蕩器振蕩5 min，再超聲提取10 min作為提取部分的操作，由表3可知改進提取方法后目標化合物的提取效果更好，回收率明顯提高。

表3 改進后的方法與國家標準方法的加標回收率的比較（n=6）

2.2 乙酸乙酯去除過程

農業部1025號公告-23-2008中分離乙酸乙酯和鹽酸采用的方法是水浴旋蒸。試驗發現水浴旋蒸的方法容易引起爆沸，且旋蒸操作比較耗時。改用分液漏斗，使用液液分配的方法直接分離，簡化了試驗操作，提高了工作效率。

2.3 離心和去脂過程

農業部1025號公告-23-2008規定，加入正己烷按3 500 r/min離心5 min對樣液進行去脂化，試驗發現轉速較低，去脂效果不好；由于正己烷未完全去除，在進行過柱操作耗時較長。提高轉速至10 000 r/min，能使樣液更好地分層，剩余正己烷采用氮吹去除后，過固相萃取柱效率更高。

2.4 檢測靈敏度

農業部1025號公告-23-2008中檢出限為0.5 μg/kg，按改進后的方法進行提取和凈化，信噪比S/N大于3，檢出限可達到0.17 μg/kg，結果表明改進后的方法靈敏度滿足方法要求。

2.5 標準曲線的選擇

農業部1025號公告-23-2008中只采用裸標作為標準曲線。此方法沒有考慮到基質效應，試驗的準確度較差。該試驗增加基質配標和隨行加標探討樣品基質對目標化合物檢測的影響。

由表4可知，采用農業部1025號公告-23-2008方法的回收率最低，采用隨行加標制作的標準曲線計算的加標回收率最高，且更接近100%。這是因為采用隨行加標消除了基質效應，且消除了因試驗操作帶來的誤差。因此，采用隨行加標方法作為試驗的標準曲線。

表4 七種磺胺類藥物裸標、基質配標、隨行加標計算的加標回收率（n=6）

接表4

3 結論

農業部1025號公告-23-2008對動物源食品中磺胺類藥物殘留的檢測有一定的指導作用，但在實際工作中發現此方法存在提取效率不高，試驗操作耗時，基質效應較大和標準曲線的選取和建立不好等問題。因此，通過對方法進行研究與探索，進一步對方法進行優化和改進。試驗從以下幾個方面對農業部1025號公告-23-2008進行了優化：（1）探究基質配標和隨行加標對回收率的影響，大大提高了方法的準確度；（2）進一步優化對樣品的提取步驟，改用水浴恒溫振蕩器振蕩5 min，再超聲提取10 min，使樣品提取更完全；（3）凈化過程的水浴旋蒸操作直接改用分液漏斗來進行對乙酸乙酯分離，避免水浴旋蒸可能引起溶液爆沸和耗時長的問題；（4）凈化步驟中提高離心轉速，使得樣液分層效果更好，并在取下層備用液時使用氮吹將液面殘余正己烷吹干，提高過柱的效率。綜上所述，通過對農業部1025號公告-23-2008方法的改進和優化，顯著提高實際的應用效果，對做好動物源食品中磺胺類藥物殘留的檢測工作具有很好的現實意義。