UPLC-MS/MS法測烘焙咖啡和速溶咖啡中丙烯酰胺

田金鳳，張喆，孫卓然，尚遠宏*

1. 攀枝花學院醫學院（攀枝花 617000）；2. 呼和浩特市疾病預防控制中心（呼和浩特 010070）

咖啡，茜草科（Rubiaceae）咖啡屬（Coffea）植物，為常綠灌木或小喬木[1]。目前，咖啡主要以原豆經烘焙、研磨、沖泡或煮沸的方式制成大眾休閑飲料，其產量和消費量逐年增加，其中速溶咖啡是從炒磨咖啡豆中提取有效成分后經干燥而生產的[2]，而烘焙咖啡是咖啡豆經烘焙工藝后再加工處理而得到的。咖啡生產過程中產生的有毒物質丙烯酰胺現成為人們關注的焦點問題，丙烯酰胺屬于二類致癌物[3]，存在于一些不同的熱處理食品中，而咖啡飲料中的丙烯酰胺的來源主要集中在烘焙或加熱處理階段[4]。在我國目前標準中GB 5009.204—2014和GB 31604.18—2016僅是關于“食品中丙烯酰胺的測定”和“食品接觸材料及制品丙烯酰胺遷移量的測定”，尚未有明確界定專屬于咖啡中丙烯酰胺的限量標準或最大殘留限量值規定[5-6]。隨著飲食習慣的改變和西方文化的影響，咖啡在我國越來越普及，因而國家在咖啡生產中要嚴格控制丙烯酰胺形成途徑，有必要建立咖啡中丙烯酰胺的痕量檢測方法。

咖啡中成分復雜、干擾物較多，測定過程中的難度較大，目前還沒有成熟可靠、快速準確的方法[7]，而以“丙烯酰胺”“咖啡”“arcylamide”“coffee”為檢索詞，從“CNKI”和“Elsevier SDOL”數據庫檢索近10年（2011—2021年）文獻報道檢測咖啡中的丙烯酰胺含量的方法和結果，具體見表1。同時近年來，液相色譜-串聯質譜法是測定咖啡中丙烯酰胺含量方法中最為提倡和通用的檢測手段，但樣品前處理對雜質干擾處理效果不佳或丙烯酰胺在色譜分析中分離效果和靈敏度有待進一步提高。此次試驗在前人研究工作的基礎上，適當改進了樣品前處理方法，并采用超高效液相色譜-串聯質譜法對咖啡中丙烯酰胺進行了測定，具有此色譜分析高效、高靈敏度等優點，其方法的回收率和重現性好，可滿足咖啡中丙烯酰胺含量的評估檢測。

表1 咖啡中的丙烯酰胺的測定方法和測定結果范圍

1 材料與方法

1.1 儀器和試劑

Agilent 6460A超高效液相色譜-串聯四極桿質譜儀（美國Agilent公司）；FA2014B電子天平（上海越平公司）；Milli-Q IQ7000超純水器（美國Millipore公司）；1-14k離心機（Sigma公司）；VORTEX 4渦旋混合器（LMS公司）；NEVAP-45氮吹儀（美國Organomation公司）；MCX固相萃取柱（800 mg/6 mL）。

色譜級甲酸、乙腈，Fisher公司；丙烯酰胺、13C3-丙烯酰胺標準品（純度均大于98%），德國Dr.Ehrenstorfer GmbH；其他試劑為國產分析純。樣品為市售不同廠家的咖啡商品。

1.2 方法

1.2.1 標準溶液的配制

分別稱取0.0100 g的丙烯酰胺標準品，分別用水溶解并定容至10 mL，質量濃度均為1.0 mg/mL，于-20 ℃避光保存。其他質量濃度標準溶液用水定量稀釋即得。

分別稱取0.0100 g的13C3-丙烯酰胺標準品，分別用水溶解并定容至10 mL，質量濃度均為1.0 mg/mL，于-20 ℃避光保存。其他濃度標準溶液用水定量稀釋即得。

1.2.2 樣品前處理

提?。悍Q取2.0 g（精確到0.01 g）咖啡樣品，置于50 mL離心管中，加入100 μL13C3-丙烯酰胺內標液（4 mg/L），靜止后加9 mL水并渦旋使試樣分散，再加入10 mL乙腈和5 mL正己烷渦旋1 min后，加入1.5 g無水醋酸鈉和6 g無水硫酸鎂搖床振搖1 h，以4 ℃，以10 000 r/min離心8 min，取乙腈層，待凈化。

凈化：取3 mL乙腈層過已活化的MCX固相萃取柱，直接收集上柱的乙腈溶液，在氮氣下吹干，用0.3 mL水溶解殘渣，過0.22 μm濾膜后，即得。

1.2.3 儀器條件

色譜條件：色譜柱，Waters BEH-C18柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）；流動相A，0.1%（V/V）甲酸-水溶液；流動相B，乙腈；梯度洗脫；流速0.2 mL/min；進樣體積10 μL；洗脫程序：0～1.2 min，流動相A為90%；1.2～3 min，A由90%降至10%；3～4.5 min，A為10%；4.5～5 min，A由10%升至90%；5～6 min，A為90%。

質譜條件：離子源，電噴霧離子源（ESI）；掃描方式，正、負離子掃描；檢測方式，多反應監測（MRM）；輔助氣（AUX）流速10 L/min；輔助氣溫度（TEM）300 ℃；電噴霧電壓（IS）3 500 V。丙烯酰胺藥物的多反應監測質譜參數見表2。

表2 質譜分析參數

1.2.4 方法的標準曲線、線性范圍及檢出限

配制好的丙烯酰胺標準儲備液用水稀釋成500 μg/L混合標準溶液，用空白咖啡基質提取液將標準溶液稀釋成5，10，25，50，100和250 μg/L系列質量濃度的標準溶液，分別進行測定，其中含50 μg/L內標13C3-丙烯酰胺。以質量濃度為橫坐標，定量離子峰面積為縱坐標，采用外標法建立標準曲線。以3倍信噪比（S/N≥3）和10倍信噪比（S/N≥10）分別確定檢出限（LOD）與定量限（LOQ）[18]。

2 結果與分析

2.1 提取條件和儀器條件優化

樣品提取過程中首先用正己烷將脂肪及低極性化合物除去[7]，再把無水硫酸鎂和無水醋酸鈉作為除水劑，醋酸鈉則加大水中的離子強度，因鹽析作用將樣品中水層和有機試劑乙腈層分離，而無水硫酸鎂是由于其和水分子結合來起到除水作用[19-20]。儀器條件中，流動相中加入少量甲酸能夠達到改善峰形、提高分離效率的作用，且可以為丙烯酰胺提供必需的質子來源，提高其離子化效率；在ESI+模式下，優化碰撞能量，丙烯酰胺經過兩級碰撞掃描后，產生不同強度的離子碎片，分別以響應值最大的荷質比（m/z）作為各目標化合物的定量離子，丙烯酰胺在250.0 μg/L時的MRM色譜圖見圖1。

圖1 丙烯酰胺及內標的定量離子色譜圖

2.2 方法的線性關系及檢出限

向空白咖啡基質溶液中加入系列丙烯酰胺標準溶液和內標溶液，以峰面積對應的濃度進行線性回歸，結果見表3。由表3可知，在5.0～250.0 μg/L線性范圍內其線性關系良好，相關系數（R）＞0.999。定量限為1.0 μg/kg，檢出限為0.5 μg/kg。結果表明，方法的靈敏度能滿足檢測要求，并優于現行國家標準[5]。

表3 丙烯酰胺的線性范圍、回歸方程和相關系數

2.3 方法的回收率與精密度

以1，5和10 μg/kg的水平將丙烯酰胺添加到空白咖啡基質中（空白樣品分別添加不同濃度的標準液，各6份），測定回收率，結果見表4。丙烯酰胺在咖啡中的回收率范圍為81.2%～89.3%，SRSD為5.1%～6.3%。

表4 丙烯酰胺的添加回收率和相對標準偏差（n=6）

2.4 實際樣品分析

按試驗方法對市售烘焙咖啡和速溶咖啡各10個樣品中的丙烯酰胺進行分析，結果顯示，烘焙咖啡中丙烯酰胺質量分數范圍為71.2～103.1 μg/kg，速溶咖啡中丙烯酰胺質量分數范圍為5.5～316.1 μg/kg。

3 結論

此次試驗結合固相萃取技術，以高效液相色譜-串聯質譜法建立了咖啡中丙烯酰胺的分析測定方法。該方法前處理操作簡單，凈化效果好，靈敏度高，干擾少，其檢測定量限（SLOQ）為1 μg/kg，小于GB 5009.204—2014標準檢測低限（10 μg/kg），在實際檢測中具有較強的可行性和實用性，可用于食品安全風險監測咖啡樣品中丙烯酰胺含量的測定。