苦蕎全基因組SSR位點挖掘及遺傳多樣性分析

左茜茜 ， 宋英杰 ， 馬心妍 ， 楊云卉 ， 王軼菲 ，郭澤光， 朱雄智， 劉越*

（1.中央民族大學民族地區生態環境國家民委重點實驗室，北京 100081；2.中央民族大學生命與環境科學學院，北京 100081）

苦蕎（Fagopyrum tataricum L.Gaerth）又名韃靼蕎麥，屬雙子葉蓼科（Polygonaceae）蕎麥屬（Fagopyrum Mill），是一種典型的藥食同源小宗作物[1-2]。我國苦蕎種植歷史悠久，種植面積和產量均位居世界前列，不僅是苦蕎的集中分布區，也是該物種的擴散源[3]。苦蕎因其生長快速、適應性強、抗逆性優異和活性成分豐富的優點，成為我國云貴川高原、青藏高原、甘肅甘南、鄂湘武陵山區丘陵山地等地區的重要糧食作物之一[4-6]。研究證實，苦蕎含有大量對人體有益的物質[7]，包括具有抗菌、保肝、抗癌等生物功能的蒽醌類[8-9]及對心血管系統、消化系統、內分泌系統等具有廣泛調節作用的黃酮類[10]和醌類等化合物。

分子標記是遺傳多樣性研究的主要方法。隨著苦蕎全基因組[11]及相關組織轉錄組測序數據的公布，SSR（simple sequence repeat）標記[12]在苦蕎種質資源研究中的應用非常廣泛。但相比于其他植物，苦蕎的分子標記技術起步較晚，所開發的SSR數量有限，無法滿足其資源鑒定、分子育種和功能基因發掘等方面的需要，且目前對苦蕎基因組染色體序列SSR位點挖掘有限[13]，主要是通過轉錄組序列獲得[14-18]。因此，本研究利用GenBank數據庫中苦蕎的8條染色體基因組序列對每條染色體特異性的SSR位點進行挖掘，并篩選SSR多態性高的引物對苦蕎樣品進行遺傳多樣性評價，以期為苦蕎種質資源的鑒定分析以及苦蕎分子標記輔助育種奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

SSR引物開發序列來自苦蕎全基因組8條染色體（SAMN07780272）[11]。序列數據以.fasta文件形式從NCBI數據庫（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/38383）獲取。第1到8號染色體長度分別為 68.03、61.24、57.71、56.66、53.88、52.29、51.55、49.98 Mb，GC含量在38%左右。

SSR多態性檢測和苦蕎遺傳多樣性分析材料共計42份，由本課題組于2019年8月野外調查時收集并保存，包括從四川涼山彝族自治州3個縣收集到的苦蕎地方品種32份，科研單位提供的苦蕎品種10份，其中中國西南野生生物種質資源庫提供3份（四川攀枝花、西藏、河北野生苦蕎樣品各1份）、云南滇臺中心提供3份（山西、云南、重慶黑苦蕎各1份）、貴州師范大學提供4份（貴州黑苦蕎3份、湖南黑苦蕎1份），樣品編號詳見表1。

表1 42份樣品來源Table 1 Origin of 42 samples

1.2 試驗方法

1.2.1 DNA提取 2019年9月，42份材料恒溫種植于中央民族大學民族植物學實驗室培養箱（25℃，16 h光照，8 h黑暗）。每份材料在培養皿內種植20粒，于苗期收集鮮嫩葉片3～5片，利用剪刀剪碎，采用植物基因組DNA提取試劑盒（天根生化科技有限公司）提取DNA，利用Nano Drop 2000檢測DNA質量，置于-20℃保存。

1.2.2 SSR開發 利用Perl語言環境下的MISA軟件（http://pgrc.ipk-gatersleben.de/misa/）搜索苦蕎8條染色體序列基因組的SSR位點，設置SSR檢索標準：檢索重復單元為2、3、4、5、6 bp，重復長度≥12 bp；二核苷酸最小重復次數≥6次（總長度不少于12個堿基），三至六核苷酸最小重復次數≥5次（總長度不少于15、20、25和30 bp）。利用Excel對二至六核苷酸重復基元SSR進行相關統計和比較分析。

1.2.3 SSR引物設計與篩選 采用Primer 3.0引物批量設計程序對二至六核苷酸重復類型以及復合的SSR位點兩端序列設計特異性引物，目的產物大小在100～300 bp之間，引物由通用生物系統（安徽）有限公司合成。選取12份苦蕎樣品DNA混合建池用于篩選多態性引物。PCR反應體系20μL：DNA模板2μL，Taq0.2μL，正反引物各0.3 μL（20 μmol·L-1），0.4 μL dNTPs，2 μL Buffer和14.8μL ddH2O。PCR擴增反應程序：94℃預變性5 min；94℃變性30 s，54℃（退火溫度在54℃上下波動）退火35 s，72℃延伸40 s，35個循環；72℃延伸3 min。每對引物的擴增產物隨機抽取樣品，取3μL進行1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測。將甲酰胺與分子量內標按100∶1的體積比混勻后，取15μL加入上樣板中，再加入1μL稀釋10倍的PCR產物，使用3730 XL測序儀（ABI）進行毛細管電泳。利用Genemarker中的Fragment（Plant）片段分析軟件對測序得到的原始數據進行分析，將各泳道內分子量內標的位置與各樣品峰值的位置做比較分析，得到片段大小。

1.2.4 數據處理與聚類分析 根據統計帶型數據分析各個位點等位基因頻率，利用PIC-CALC計算SSR位點的多態性信息含量PIC（polymorphism information content）。利用Popgene 3.2計算有效等位基因（Ne）、Nei’s指數（H）、Shannon-Weaver多樣性指數（I）和遺傳相似系數。利用軟件NTSYS-pc 2.10進行UPGMA聚類分析。

2 結果與分析

2.1 苦蕎基因組SSR位點特征分析

2.1.1 SSR出現的頻率 苦蕎8條染色體序列總長度約為451.34 Mb，共檢出51 485個SSR，SSR位點平均發生率（檢出的SSR個數與染色體總長度的比值）為114.07 Mb-1；苦蕎基因組SSR種類較為豐富，二至六核苷酸重復類型均有，但各類型出現的頻率相差較大。檢出的苦蕎SSR種類主要集中在二和三核苷酸重復，占總數的95.96%，且二核苷酸重復遠大于三核苷酸重復，分別占78.20%和17.76%，四至六核苷酸重復所占比例較小，總計4.04%。各類型重復相對豐度（某類型重復SSR數量與染色體總長度比值）最大及最小者分別為二核苷酸（89.1 Mb-1）和六核苷酸（0.32 Mb-1）。逐條染色體分析可知，分布在每條染色體上SSR位點的數量和種類特征較為一致。1號染色體檢出SSR數量最多（7 659個），其次是2號染色體（7 033個），檢出數量較少的為7號（5 768個）和8號染色體（5 721個）；SSR位點平均發生率最小的為4號染色體（116.24 Mb-1），最大的為7號染色體（111.89 Mb-1）；二至四核苷酸重復基元數量最多者均為1號染色體，五核苷酸、六核苷酸重復基元數量最多的為2號染色體；二核苷酸、五核苷酸、六核苷酸重復基元數量最少的均為8號染色體，三核苷酸重復基元數量最少者為7號染色體998個，四核苷酸重復基元數量最少者為5號染色體。除了四核苷酸重復，其余重復類型的SSR數量在每條染色體上的趨勢波動不大（圖1）。

圖1 8條染色體SSR各重復類型數量Fig.1 Number of SSR repeats on 8 chromosomes

2.1.2 SSR重復類型和比例 搜索到的苦蕎基因組SSR共包含361種重復類型：二核苷酸重復類型有6種，三至六核苷酸重復類型分別有30、75、129和121種，每種類型的分布并不平均。從出現頻率來看，二核苷酸重復類型中出現最多的為AT/TA，占SSR總數的69.60%，遠遠高于其他類型；其次，CT/GA的頻率較高為4.29%；AG/TC、AC/TG、CA/GT出現的頻率較低，所占比例較小。三核苷酸重復類型出現頻率排名前3的為AAT/TTA、AGA/TCT和 ATA/TAT，分別占了 2.49%、2.10%和2.04%；其次AAG/TTC、CTT/GAA、ATT/TAA分別占1.67%、1.52%、1.51%；其他類型出現頻率比較低。四核苷酸重復類型AAAT/TTTA（0.60%）和五核苷酸重復類型中AAAAT/TTTTA（0.06%）出現頻率較高，六核苷酸重復類型出現頻率都極低（表2）。

表2 苦蕎基因組序列不同SSR的出現情況Table 2 Occurrence of different SSRs in tartary buckwheat genome sequence

逐條染色體分析可知，不同染色體上優勢重復類型沒有顯著差異，數量上有一定變化。二核苷酸重復類型AT/TA在1號染色體數量最多（5 194個），在8號染色體數量最少（3 901個）；三核苷酸重復類型AAT/TTA數量最多及最少分別為3號染色體（183個）及4號、6號和8號染色體（同為144個）；四核苷酸重復類型AAAT/TTTA數量最多（60個）的為1號染色體，最少的為3號染色體（0個）；五核苷酸重復類型AAAAT/TTTTA數量最多（9個）的為2號染色體，數量最少（0個）的為4號染色體；六核苷酸重復類型分布較為均勻，在每條染色上的數量變動較小。

2.1.3 SSR特異種類分布 對每條染色體上的重復基元類型、特異基元類型（唯一性）進行統計。各條染色體的特異基元類型主要集中在四至六核苷酸重復上，在二、三核苷酸重復上無分布（表3）。4號染色體可作為探究四核苷酸重復特異類型的最佳序列，特異類型包括AGTG/TCAC、ATAC、ATCA、CCAG、GGAG、GTTG和TAGG 7種；2號染色體可作為探究五核苷酸重復特異類型的最佳序列，包括AGAAA、ACATA、CCCAC、GTCCG和TATCT等14種；1號和2號染色體均可作為探究六核苷酸重復特異類型的最佳序列，每條染色體都有17種特異類型，其中1號染色體包括AATCTC、AGTGTA、 CAATAG、 CTTTCT、 GAGACT 和GGTTCG等，2號染色體包括ACCGCC、AGCAGA、CCAATC、CTTAGT、GGACGT和TCTCCC等。

表3 苦蕎基因組SSR特異種類分布Table 3 Distribution of specific species of Tartary buckwheat genomic SSR

2.1.4 SSR重復次數和長度 隨著重復次數的增加，所有類型的SSR數量均呈現減少趨勢（圖2）。5～15次為較低重復次數，分布有36 634個SSR，占總數的71.15%，說明低重復次數是苦蕎基因組SSR的主要特點之一；大于15次為較高重復次數，分布有14 851個SSR，占總數的28.85%，其中14 388個為二核苷酸重復；最高重復次數是95次。

圖2 苦蕎基因組SSR重復次數分布Fig.2 Distribution of SSR motif repeat number in tartary buckwheat

苦蕎全基因組SSR基序長度分布情況見圖3。其SSR基序長度跨度較大，為12～228 bp；總的來說，基序長度在12～20 bp范圍內的有29 827個，占57.93%；20～50 bp的SSR數量為11 715個，占22.75%，50～100 bp的SSR數量為9 033個，占17.54%，＞100 bp的SSR數量為910個，占1.78%。檢出的苦蕎SSR基序長度主要集中在12～100 bp范圍內（98.42%）。SSR基序的長度在每條染色體上呈現的變化趨勢類似（數據未列出）。

圖3 苦蕎SSR基序長度分布范圍Fig.3 Distribution range of SSR motif length of tartary buckwheat

2.2 苦蕎基因組SSR引物的多態性檢測

2.2.1 不同SSR引物類型分析 按照SSR在基因組中分布的比例共合成了156對引物（表4），其中，二核苷酸重復SSR引物119個，占76.28%，基序長度范圍為12～128 bp，三核苷酸重復類型SSR引物26個，占16.67%，基序長度范圍為15～69 bp，還有3個復合SSR引物。

通過毛細管電泳和DNA瓊脂糖電泳對設計的156條特異性引物，從苦蕎樣品DNA分子材料中選取12份構建混合池對引物進行篩選。經檢測，有120對引物可擴增出目的條帶，有效比例為76.92%。保留擴增條帶比較清楚明亮的引物，去除非特異性擴增的條帶，共有17對引物具有較好的重復性和豐富的多態性（表4），多態性比率為10.90%。其中，二核苷酸重復SSR引物11個，占64.71%，基序長度范圍為14～66 bp；三核苷酸重復類型SSR引物4個，占23.53%，基序長度范圍為15、27、48和63 bp；還有2個復合SSR引物，基序長度為55和66 bp。

表4 不同SSR引物類型的統計Table 4 Statistics of different SSR primer types

2.2.2 引物多樣性分析 用篩選的17對引物評價分析42份樣品的遺傳多樣性，結果如表5所示。共產生114個等位基因，每個位點平均等位基因6.706個。引物P90等位基因數最高（14個），而引物P89最少，等位基因數為2個。所有擴增產物的片段在84 bp左右。每對引物的觀察等位基因數（Na）和有效等位基因數（Ne）平均為6.706個（P90最高為14個，P89最低為2個）和2.718個（P91最高為5.188個，P89最低為1.214個）。各引物的Shannon多樣性指數在0.397至2.101之間，平均值為1.155。P1的PIC值最高（0.794），P89的PIC值最低（0.161），17對引物的平均PIC值為0.499。觀察雜合度（Ho）變化范圍為0.048至1.000之間，平均值為0.881。

表5 17對引物遺傳多樣性信息Table 5 Genetic diversity information of 17 pairs of primers

2.3 苦蕎遺傳多樣性分析

2.3.1 苦蕎樣品遺傳多樣性分析 根據42份樣品的遺傳相似系數，采用UPGMA進行聚類分析（圖4）。在遺傳相似系數為0.35時，可將42份樣品劃分為3類：第Ⅰ類只有1份樣品，為四川省攀枝花市的野生苦蕎（XNZY-1）；第Ⅱ類共4份樣品，包括2份野生苦蕎樣品（XNZY-2和XNZY-5，分別來自西藏和河北）、1份湖南樣品（GZSF-2）及1份山西樣品（DTZX-1)；在涼山彝族自治州收集的苦蕎地方品種（黑苦蕎、普通黃苦蕎）被聚為第Ⅲ類，共有37份樣品，分為2個亞類（Ⅲa和Ⅲb）。Ⅲa包括3份黃苦蕎樣品（EN-G-TU、CHU-GE、ENG-WA-ZI）、3份美姑縣黑苦蕎樣品、6份昭覺縣樣品和1份云南滇臺中心樣品（DTZX-2），共計13份樣品；Ⅲb包括5份美姑縣黑苦蕎樣品、5份昭覺縣黑苦蕎樣品、9份布托縣黑苦蕎樣品、3份貴州樣品（GZSF-1、GZSF-3和 GZSF-4）、1份 重慶樣 品（DTZX-5）和黃苦蕎（EN-G-JIE），共計24份樣品。

圖4 苦蕎資源遺傳相似性聚類Fig.4 Clustering of genetic similarity of tartary buckwheat resources

2.3.2 苦蕎樣品群體多樣性分析 根據苦蕎地方品種的來源可將42個樣品分為8個群體，主要包括3個涼山地區黑苦蕎群體（Z群體、M群體、B群體）、2個涼山地區黃苦蕎對照群體（E群體、C群體）和3個外地苦蕎群體（D群體、X群體、G群體）。苦蕎地方品種的群體遺傳多樣性如表6所示。觀察等位基因數（Na）和有效等位基因數（Ne）的平均值分別為2.449個（Z群體昭覺縣最高為3.471個，C群體CHU-GE最低為1.063個）和1.956個（M群體美姑縣最高為2.406個，C群體CHU-GE最低為1.063個）。Shannon多樣性指數（I）的平均值為0.630，8個群體中，M群體美姑縣最高（0.899），C群體CHU-GE最低（0.043）。實際雜合度（Ho）、預期雜合度（He）和Nei指數分別為0.885、0.115和0.367。

表6 不同群體遺傳分析統計Table 6 Statistics of genetic analysis of different populations

基于8個群體黑苦蕎及苦蕎地方品種的遺傳距離（表7）進行UPGMA聚類分析（圖5）。在遺傳距離0.48處可將8個群體劃分為3類，其中第Ⅰ類和第Ⅱ類都包含一個類群，分別為西南種子庫野生苦蕎和刺苦蕎（CHU-GE）；黑苦蕎主要被聚為第Ⅲ類，該類包含了來自美姑、昭覺和布拖縣的黑苦蕎和黃苦蕎。

表7 8個群體遺傳距離Table 7 Genetic distance of 8 populations

圖5 基于遺傳相似性苦蕎群體的聚類Fig.5 Clustering of tartary buckwheat populations based on genetic similarity

3 討論

3.1 苦蕎基因組SSR位點特征分析

常用多態性作為判定分子標記可用性的參考指標之一，SSR重復基元的長度對于其多態性具有重要影響[19]。通常重復基元長度在12 bp以下時SSR的多態性較低，長度在12～20 bp之間時多態性中等，長度＞20 bp時具有高度多態性[20]。本研究從苦蕎8條染色體序列中獲得的SSR重復基元長度范圍是12～228 bp，其中12～20 bp范圍內的SSR占57.93%，＞20 bp的SSR占42.07%。此外，一至三核苷酸重復屬于低級重復基元，且低級重復基元類型的SSR多態性普遍要比高級重復基元類型高[21]。本研究檢出的SSR重復基元類型以二、三核苷酸重復為主，占總數的95.96%。可以推斷本研究開發的SSR位點具有潛在的高多態性。共設計合成156對引物，其中120對能擴增出條帶，有效率約為77%，17對多態性較好的引物中不存在四堿基和五堿基重復基元，基序長度＞20 bp的約占72%，與上述結果一致。

根據基因組序列數據，共獲得51 485個SSR位點。SSR的分布頻率為114.07 Mb-1，即相鄰SSR位點的平均距離為8.76 kb。Hou等[22]預估苦蕎基因組SSR出現頻率為70.34 Mb-1；Fang等[23]挖掘苦蕎基因組SSR頻率為83.25 Mb-1；馬名川等[13]對苦蕎全基因組總長度為34.99 Mb的未組裝序列進行SSR檢測，平均每21.3 kb出現1個SSR位點。造成差異的原因為采用的基因組序列長度不同。此外，Fang等[23]同樣基于苦蕎8條染色體序列挖掘SSR，SSR分布頻率為83.25 Mb-1，檢索標準為一至六核苷酸重復次數最低為20、10、7、5、4、4，其結果差異可能與搜索標準有關[24]。苦蕎基因組SSR分布頻率低于同為雙子葉的擬南芥[25]、喜馬拉雅櫻花[26]、向日葵[27]，也低于單子葉植物益智[28]，可能源于不同物種的基因組差異。苦蕎基因組中SSR種類較為豐富，二至六核苷酸均有分布，但數量上有較大的差異，其主要類型為二核苷酸（78.20%）和三核苷酸（17.76%）重復，四至六核苷酸重復所占比例較小，總計4%左右，與光皮樹[29]、楊梅[30]、玉米[31]和蕎麥[32]的基因組序列開發SSR標記結果一致。同時以短重復基序為主要重復類型說明苦蕎處于相對較高的進化水平。但與基于轉錄組序列進行SSR開發的結果不同，轉錄組序列SSR開發結果以三核苷酸重復類型數量居多[14-15,17]。此差異可能與基因組與轉錄組序列的特異性等有關，如三核苷酸在表達序列標簽（expressed sequence tag,EST)里比較多，但其不會引起移碼突變而影響基因功能。從基元類型來看，在苦蕎基因組SSR中，二核苷酸基元以AT/TA為主，遠遠高于其他類型，堿基偏倚性明顯，占SSR總數的69.60%，這與苦蕎全基因組SSR[13]和普通蕎麥種子EST微衛星標記[32]分析結果一致，也與枇杷[33]、絲瓜[34]基因組研究結果相同。三核苷酸重復基元種類較多，優勢重復基元以AAT/TTA、AGA/TCT和ATA/TAT為主，與甘草[35]、燈盞花[36]、石榴[37]的全基因組SSR位點特征一致。但與苦蕎EST-SSR[17]、普通蕎麥EST-SSR[32]以AAG/TTC為主的研究結果有差異。不同物種重復基元優勢類型的差異可能與物種基因組或序列的特異性等有關，也與其受到的選擇壓力不同有關。從重復次數來看，低重復次數是苦蕎基因組SSR的主要分布特點，5～15次重復的SSR數量約占總數的71%，且隨著重復次數的增加，每個重復類型SSR出現的頻率減少。

從染色體層面看，分布在每條染色體上SSR位點的數量和種類特征較為一致。1號染色體檢出SSR數量最多（7 659個，68.03 Mb），檢出數量較少的為8號染色體（5 721個，49.98 Mb），通過對比染色體長度及SSR檢出數量，發現SSR檢出數量在一定程度上與染色體長度呈正相關；二至六核苷酸重復基元在每條染色體上的相對豐度差異不大，4號染色體SSR相對豐度（116.24 Mb-1）最大，7號染色體最小（111.89 Mb-1）。Fang等[23]研究表明，在苦蕎基因組染色體中SSR在8號染色體上的相對豐度最高（81.19 Mb-1），其次是4號染色體（80.63 Mb-1）。1號染色體上的相對豐度最低（76.61 Mb-1），但1號染色體上的SSR標記數量最多（5 212個）。本研究結果與其有一定的一致性，但SSR的相對豐度在每條染色體上存在差異。僅四核苷酸重復基元在每條染色上的數量有較明顯波動趨勢，在對四核苷酸重復進行特異研究時可針對性地選擇染色體；各優勢重復基元數量在染色體的分布與也與染色體長度存在一定正相關，1號和2號可作為優勢重復基元篩選的最佳序列材料；對每條染色體上的特異重復類型數量進行統計發現，特性重復類型主要存在于高級重復基元（四至六核苷酸重復）。本文對苦蕎8條染色體序列上的特異性SSR進行分析，豐富了苦蕎基因組SSR位點的信息，為之后育種篩選奠定基礎。綜合來看，無論從SSR出現頻率、基元類型的豐度，還是重復次數及長度來說，1號、2號染色體可作為大量SSR開發的優質序列選擇；通過對不同染色體所檢出的SSR類型進行分析，發現不同染色體能檢出的SSR種類具有特異性，研究者可根據不同科研需求，選擇苦蕎的不同染色體獲得理想的SSR分子標記。

3.2 苦蕎遺傳多樣性分析

本研究利用Primer 3.0軟件設計了156對SSR引物，主要類型為二核苷酸重復。17對多態性較好平均等位基因為6.70個。比韓瑞霞[18]對不同地理來源的苦蕎核心種質多樣性研究時獲得的平均3個等位基因數量高，也比Senthikumaran[38]對喜馬拉雅地區蕎麥多樣性研究的平均6.5個等位基因高，造成的原因可能源于苦蕎的來源地差異。PIC≥0.5時，該基因座位具有高度多態性；當0.25≤PIC＜0.5時，為中度多態性；PIC＜0.25時，為低度多態性[39]。17條多態性較好的引物擴增得到的PIC平均為0.499，具有較高的多態性。這一數據雖然較高帆等[40]獲得的苦蕎SSR標記的PIC平均值0.88低，但比杜偉等[14]獲得的苦蕎SSR標記的PIC平均值（0.4）高，為充分利用開發苦蕎資源和完善苦蕎遺傳背景分析提供了參考。所有供試材料Shannon多樣性指數為1.15，也表明在材料收集地苦蕎地方品種具有較高的多樣性。

利用17對引物對收集到的42份黑苦蕎及苦蕎樣品進行多樣性分析。結果發現，個體間普遍親緣關系較近，且不止存在不同縣的樣品聚在一起的情況，同時其與云南、重慶、貴州的品種聚類也非常靠近，能與山西、湖南、西藏、河北的樣品有明顯區分。與云貴川的苦蕎種質資源遺傳多樣性普遍高于其他區域苦蕎遺傳多樣性，且普遍親緣關系較近的結果一致[40-42]。基于不同群體遺傳距離的聚類結果發現，不同群體苦蕎種質資源沒有明顯的地理來源地分化。8個群體的聚類能將栽培苦蕎與西南種質資源庫提供的野生苦蕎種質資源進行區分；美姑縣的黑苦蕎樣品多樣性最高，其次是昭覺縣，布拖縣的樣品主要聚為同一分支，多樣性顯著低于另外2個縣。結合課題組前期實地調查結果發現[43]，美姑縣和昭覺縣種植的黑苦蕎多于布拖縣，而且在生活中，農民維持著以傳統交換、購買等方式以獲取苦蕎種子，保持著頻繁的種子交換，使得涼山彝族自治區內苦蕎種子得以流動遷移；另外，美姑縣提出了“四川美姑苦蕎栽培系統”，高度重視苦蕎栽培系統傳統知識的挖掘與保護有關，鼓勵當地人種植多種苦蕎傳統品種，一定程度上對苦蕎地方品種多樣性的維系具有良性作用。

本研究利用MISA軟件對苦蕎基因組8條染色體序列的二至六核苷酸重復的SSR位點進行挖掘并分析序列特征。挖掘的大量SSR特別是染色體特異性的SSR位點，對苦蕎種質資源的鑒定分析以及苦蕎分子標記輔助育種有重要意義。同時根據不同類型SSR位點設計合成引物進行多態性檢測，獲得了17對多態性較高的引物。用這17對引物對課題組前期收集的苦蕎樣品進行遺傳多樣性分析，也顯示了SSR分子標記的可用性，以及黑苦蕎的遺傳多樣性水平，對苦蕎遺傳多樣性保護研究提供了新的途徑。