HPLC 法測定不同生產(chǎn)廠家何首烏中二苯乙烯苷和蒽醌類成分的含量

代桂麗，陳言

（焦作市食品藥品檢驗所中藥室，河南 焦作 454000）

何首烏的主要功效為潤腸通便、消癰等，在腸燥便秘、風(fēng)疹瘙癢、瘡癰等治療中適用[1]。何首烏具有廣泛的自然資源分布，主要產(chǎn)于廣東、廣西、貴州、四川等地。不同廠家何首烏來源不同、成分含量不同，功效有差異。為了在臨床治療中取得最佳效果，有必要積極采取有效手段對不同廠家何首烏中成分含量進(jìn)行測定。本研究探討了不同生產(chǎn)廠家何首烏中蒽醌類和二苯乙烯苷成分含量測定中高效液相色譜法（HPLC）的應(yīng)用。

1 材料、儀器與方法

1.1 材料

何首烏飲片來源為2019年河南省專項監(jiān)督抽驗-中藥材及中藥飲片的抽驗樣品（樣品1 來源于安徽藥知源中藥飲片有限公司，樣品2 來源于河南省修之合藥業(yè)有限公司，樣品3 來源于安國安興中藥飲片有限公司，樣品4 來源于民生藥業(yè)集團(tuán)珍醫(yī)堂制藥有限公司），均為蓼科植物何首烏的干燥塊根切片。購買中國食品藥品檢定研究院研制的大黃素甲醚對照品、大黃素對照品、二苯乙烯苷對照品，含量為99.2%、98.7%、91.0%，批號分別為110758-201616、110756-201512、110844-201814。購 買 德國Merck 公司生產(chǎn)的乙腈、甲醇（色譜純），磷酸、無水乙醇、95%乙醇、甲醇均為分析純，自制純化水。

1.2 儀器

電子分析天平（Sartorius CPA225D）、紫外檢測器（Waters 2489）、高效液相色譜儀（Waters e2695），色 譜 柱（5 μm，Waters Xbridge C18，4.6 mm×250 mm），上海精宏實驗設(shè)備有限公司生產(chǎn)的電熱恒溫鼓 風(fēng) 干 燥 箱（DHG-9023A），IKA TUBE-MILL 100控制性試管研磨機(jī)，昆山超聲儀器有限公司生產(chǎn)的KQ-300VDV 型雙頻數(shù)控超聲波清洗器。

1.3 方法

1.3.1 蒽醌類成分測定

①制備對照品溶液：將適量大黃素甲醚對照品、大黃素對照品取出來，精密稱定，將甲醇加入其中溶解，分別將46.82 μg/ml 大黃素甲醚、85.28 μg/ml 大黃素溶液制備出來。②制備供試品溶液：將1 g 左右過四號篩的本品粉末取出來，精密稱定，在圓底燒瓶中置入，將50 ml 甲醇精密加入，將重量稱定，加熱回流1 h，取出，放冷，再次將重量稱定，用甲醇將減失的重量補(bǔ)足，搖勻，濾過，將5 ml 續(xù)濾液取出來，將其設(shè)定為供試品溶液A，在游離蒽醌測定中應(yīng)用。另將25 ml續(xù)濾液精密量取出來，在圓底燒瓶中置入，水浴蒸干，將20 ml 8%鹽酸溶液精密加入其中，超聲處理5 min，頻率、功率分別為40 kHZ、100 W，將20 ml 二氯甲烷加入其中，水浴中加熱回流60 min，取出，第一時間冷卻，在分液漏斗中置入，對容器進(jìn)行洗滌，在此過程中將少量二氯甲烷充分利用起來，洗液向分液漏斗中并入，將二氯甲烷液分取出來，再次用二氯甲烷振搖提取酸液3 次，每次15 ml，二氯甲烷液合并，將溶劑回收起來至干。用甲醇溶解殘渣，向10ml量瓶中轉(zhuǎn)移，將甲醇加入其中，到刻度，搖勻，濾過，將續(xù)濾液取出來，將其設(shè)定為供試品溶液B，在總蒽醌測定中應(yīng)用。③色譜條件：色譜柱：5 μm，Waters Xbridge C18，4.6 mm×250 mm。流動相比例：甲醇∶0.1%磷酸=80∶20。流速、檢測波長、柱溫、進(jìn)樣量分別為1 ml/min、254 mm、35℃、10 μl。依據(jù)大黃素峰將理論塔板數(shù)計算出來，在3000 及以上。④專屬性：將大黃素甲醚對照品溶液、大黃素對照品溶液、空白溶劑、供試品溶液A 取出來分別進(jìn)樣，將圖譜記錄下來。

1.3.2 二苯乙烯苷含量測定

①制備對照品溶液：將適量2，3，5，4'-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡糖苷對照品取出來，精密稱定，將稀乙醇加入其中，將0.269 mg/ml 對照品溶液制備出來，備用。②制備供試品溶液：將0.2 g 左右過四號篩后的本品粉末取出來，精密稱定，在圓底燒瓶中置入，將25 ml 稀乙醇精密加入，將重量稱定，加熱回流30 min，放冷，再次將重量稱定，用稀乙醇將減失的重量補(bǔ)足，搖勻，靜置，濾過，將續(xù)濾液取出來，即得。③色譜條件：色譜柱：5 μm，Waters Xbridge C18，4.6 mm×250 mm。 流動相比例：乙腈∶水=25∶75。流速、檢測波長、柱溫、進(jìn)樣量分別為1 ml/min、320 nm、35 ℃、10 μl。依據(jù)2，3，5，4'-四羥基二苯乙烯-2-Oβ-D-葡糖苷峰將理論塔板數(shù)計算出來，在2000 及以上。④專屬性：將二苯乙烯苷空白溶劑、樣品溶液、對照品溶液取出來，進(jìn)樣前用0.45 μm 微孔濾膜濾過，將圖譜記錄下來。二苯乙烯苷樣品溶液、對照品溶液的保留時間均為約4.2 min，空白溶劑無干擾。

1.3.3 何首烏中蒽醌類和二苯乙烯苷成分含量測定

將不同廠家樣品取出來，將總蒽醌、游離蒽醌供試液制備出來，依據(jù)色譜條件進(jìn)樣，對游離蒽醌、總蒽醌含量進(jìn)行測定，結(jié)合蒽醌含量=總蒽醌含量-游離蒽醌含量。并將供試液制備出來，依據(jù)色譜條件進(jìn)樣，對二苯乙烯苷含量進(jìn)行測定。

2 結(jié)果

2.1 蒽醌類成分測定

2.1.1 線性關(guān)系

將0.5 ml、1 ml、2 ml、4 ml、6 ml、8 ml 大黃素對照品溶液分別精密量取出來，在10 ml 量瓶中放置，向刻度稀釋，在此過程中將甲醇充分利用起來，搖勻，依據(jù)色譜條件進(jìn)樣分析。將0.75 ml、1.5 ml、3 ml、5 ml、7 ml、9 ml 大黃素甲醚對照品溶液分別精密量取出來，在10 ml 量瓶中放置，向刻度稀釋，搖勻后依據(jù)色譜條件進(jìn)樣分析。將橫坐標(biāo)設(shè)定為濃度，將縱坐標(biāo)設(shè)定為峰面積，將回歸方程計算出來，將標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制出來。大黃素、大黃素甲醚的回歸方程分別為y=36 943.31x+212（r=0.999 6）、y=34 930.18x+325（r=0.9999），0.0043～0.0682 mg/ml、0.004～0.042 mg/ml 范圍內(nèi)分別具有良好的線性關(guān)系。

2.1.2 穩(wěn)定性試驗

將供試品溶液A 取出來，依據(jù)色譜條件進(jìn)樣分析，定時進(jìn)樣，將1 d 內(nèi)大黃素甲醚、大黃素峰面積記錄下來，RSD=1.02%、0.98%，樣品具有良好的穩(wěn)定性。

2.1.3 精密度試驗

將供試品溶液A 取出來，依據(jù)色譜條件進(jìn)樣分析，連續(xù)進(jìn)樣6 次，將大黃素甲醚、大黃素峰面積記錄下來，RSD=0.76%、1.02%，儀器具有良好的精密度。

2.1.4 重復(fù)性試驗

將6 份何首烏細(xì)粉分別稱取出來，每份約1 g，將游離蒽醌供試液制備出來，依據(jù)色譜條件進(jìn)樣分析，將大黃素甲醚、大黃素峰面積記錄下來，將含量、RSD 計算出來，平均含量分別為0.033%、0.087%，RSD=0.26%、1.11%，均具有良好的重現(xiàn)性。

2.1.5 加樣回收率試驗

將0.25 g 已知含量的何首烏粉末取出來，分取6 份，精密稱定。將1.5 mg 大黃素對照品、0.5 mg 大黃素甲醚對照品精密稱定，在10 ml 量瓶中分別置入，定容過程中將甲醇充分利用起來。將1ml 大黃素對照品溶液（0.15 mg 大黃素）、1 ml 大黃素甲醚對照品溶液（0.05 mg 大黃素甲醚）加入樣品中，再次將23 ml 甲醇精密加入，稱重，加熱回流1 h，放冷，過濾，將續(xù)濾液取出來，將其設(shè)定為供試品，過濾過程中用0.45 μm 微孔濾膜濾過，進(jìn)樣，將峰面積記錄下來，將回收率計算出來。大黃素的平均回收率為98.03%，RSD=0.86%，大黃素甲醚的平均回收率為95.46%，RSD=2.88%，具有良好的回收率。大黃素加樣回收試驗結(jié)果見表1，大黃素甲醚加樣回收試驗結(jié)果見表2。

表1 大黃素加樣回收試驗結(jié)果分析

表2 大黃素甲醚加樣回收試驗結(jié)果分析

2.1.6 檢測限和定量限

將適量大黃素甲醚、大黃素標(biāo)準(zhǔn)溶液取出來，在10 ml 量瓶中置入，將甲醇加入其中，向刻度稀釋，搖勻，將其設(shè)定為大黃素甲醚、大黃素檢出限系列溶液。稀釋對照品溶液后進(jìn)樣檢測，將各色譜峰面積記錄下來，將檢出限、定量限檢測標(biāo)準(zhǔn)分別設(shè)定為S/N=3、S/N=10，大黃素甲醚、大黃素的檢出限分別為4.46 ng、10.07 ng，定量限分別為12.57 ng、34.02 ng。

2.2 二苯乙烯苷含量測定

2.2.1 線性關(guān)系

將二苯乙烯苷對照品溶液取出來，將1 ml、2 ml、3 ml、4 ml、6 ml、8 ml 分 別 精 密 量 取 出來，在10 ml 量瓶中置入，向刻度稀釋，搖勻，過濾過程中用0.45 μm 微孔濾膜濾過，向液相色譜儀注入，將峰面積記錄下來。將橫坐標(biāo)設(shè)定為對照品濃度，將縱坐標(biāo)設(shè)定為峰面積，將回歸方程擬合出來，即y=38656071x+25198（r=0.9996），0.027～0.215 mg/ml 范 圍 內(nèi) 具 有良好的線性關(guān)系。

2.2.2 穩(wěn)定性試驗

將供試品溶液取出來過濾，在此過程中用0.45 μm 微孔濾膜濾過，定時進(jìn)樣，對1 d 內(nèi)二苯乙烯苷峰面積進(jìn)行測定，RSD=1.12%，1 d 內(nèi)樣品穩(wěn)定。

2.2.3 精密度試驗

將供試品溶液取出來過濾，在此過程中用0.45 μm 微孔濾膜濾過，連續(xù)進(jìn)樣6 次，對二苯乙烯苷峰面積進(jìn)行測定，RSD=1.03%，儀器具有良好的精密度。

2.2.4 重復(fù)性試驗

將6 份何首烏細(xì)粉分別取出來，每份0.2 g 左右，精密稱定，將供試液制備出來，依據(jù)色譜條件進(jìn)樣，對峰面積進(jìn)行測定，將含量計算出來，二苯乙烯苷平均含量為3.66%，RSD=0.98%，具有良好的重現(xiàn)性。

2.2.5 加樣回收率

將0.05 g 左右已知含量的何首烏粉末稱取出來，精密稱定，平行6 份。另將8 mg 二苯乙烯苷對照品精密稱定，在10 ml 量瓶中置入，溶解、定容過程中將稀乙醇充分利用起來。將1.5 ml 對照品溶液（1.2 mg 二苯乙烯苷）加入每份樣品中，然后將11 ml 稀乙醇精密加入，稱重，加熱回流30 min，放冷，過濾，將5 ml 續(xù)濾液取出來，在10 ml 量瓶中置入，向刻度稀釋，將其設(shè)定為供試品，依據(jù)色譜條件進(jìn)樣，對峰面積進(jìn)行測定，將含量計算出來，平均加樣回收率為96.58%，RSD=2.05%，回收率與要求相符。二苯乙烯苷加樣回收試驗結(jié)果見表3。

表3 二苯乙烯苷加樣回收試驗結(jié)果分析

2.2.6 檢測限和定量限

將適量二苯乙烯苷標(biāo)準(zhǔn)溶液精密量取出來，在10 ml 量瓶中置入，將甲醇加入其中，向刻度稀釋，搖勻，將其設(shè)定為二苯乙烯苷檢出限系列溶液。稀釋對照品溶液后進(jìn)樣檢測，將各色譜峰面積記錄下來，將檢出限、定量限檢測標(biāo)準(zhǔn)分別設(shè)定為S/N=3、S/N=10。二苯乙烯苷的定量限、檢出限分別為97.58 ng、36.14 ng。

2.3 不同廠家何首烏中蒽醌類和二苯乙烯苷成分含量測定

樣品1、樣品2、樣品3、樣品4 中結(jié)合蒽醌含量分別為0.15%、0.20%、0.20%、0.25%，二苯乙烯苷含量分別為2.10%、2.60%、2.65%、2.48%，均與藥典要求相符，具有較高的質(zhì)量。

3 討論

3.1 何首烏化學(xué)成分分析

二苯乙烯苷、含蒽醌類化合物等是何首烏的主要化學(xué)成分[3]。有研究表明[4]，二苯乙烯苷能夠?qū)夏臧V呆、動脈硬化進(jìn)行防治，促進(jìn)記憶功能、免疫功能的提升、膽固醇的降低，對肝臟進(jìn)行保護(hù)，將抗衰老作用發(fā)揮出來等。大黃素甲醚、大黃素等是蒽醌類主要成分，在植物體內(nèi)存在的形式主要有兩種，即糖苷結(jié)合態(tài)、游離態(tài)，能夠促進(jìn)免疫功能的提升，有抗腫瘤作用及肝毒性[5]。

3.2 不同廠家何首烏化學(xué)成分HPLC 檢測結(jié)果分析

有研究表明[6]，何首烏生產(chǎn)廠家不同，其二苯乙烯苷、蒽醌類含量存在差異。本研究結(jié)果表明，樣品1、樣品2、樣品3、樣品4 中結(jié)合蒽醌含量分別為0.15%、0.20%、0.20%、0.25%，二苯乙烯苷含量分別為2.10%、2.60%、2.65%、2.48%，均與藥典要求相符，藥品含量穩(wěn)定，具有較高的質(zhì)量，和上述研究結(jié)果一致，說明HPLC 法具有良好的重現(xiàn)性、較高的準(zhǔn)確性、較為快捷的操作，在評價何首烏藥材及其復(fù)方制劑質(zhì)量的過程中適用。

綜上所述，不同生產(chǎn)廠家何首烏中蒽醌類和二苯乙烯苷成分含量均與藥典要求相符，有較高的質(zhì)量。蒽醌類和二苯乙烯苷成分含量測定中HPLC 在控制質(zhì)量中起著重要作用，值得推廣。