LncRNA UNC5B- AS1 對膠質母細胞瘤細胞增殖、遷移及侵襲的影響研究

康明明，田軼楠，鄭紅艷，張銘芙，潘云志

1.齊齊哈爾醫(yī)學院附屬第三醫(yī)院神經內科三病房，黑龍江齊齊哈爾 161000；2.齊齊哈爾醫(yī)學院附屬第三醫(yī)院神經內科二病房，黑龍江齊齊哈爾 161000；3.齊齊哈爾醫(yī)學院附屬第三醫(yī)院呼吸內科二病房，黑龍江齊齊哈爾 161000；4.齊齊哈爾醫(yī)學院附屬第三醫(yī)院神經外科一病房，黑龍江齊齊哈爾 161000；5.齊齊哈爾醫(yī)學院附屬第三醫(yī)院神經內科一病房，黑龍江齊齊哈爾 161000

膠質母細胞瘤（GBM）屬于神經系統(tǒng)疾病，一般為原發(fā)性惡性腫瘤，常在成年人中高發(fā)，具有發(fā)病率、致死率高，預后差的特點，是星形細胞腫瘤中惡性程度最高的膠質瘤，對于膠質母細胞瘤的治療，臨床上廣泛應用的一般以手術、 放化療及分子靶向等治療為主要趨勢， 即便如此仍不能緩解膠質母細胞瘤的惡性進展趨勢[1-4]。 長鏈非編碼RNA 是一種長度大于200 nt 的內源性非編碼性RNA， 由RNA 聚合酶所轉錄[5]。UNC5B-AS1 是lncRNA 家族的成員之一，而且它是血管內皮素的受體之一，由于其特殊性，它參與到介導netrin-1 的排斥作用中，這些蛋白質參與細胞的促凋亡及抗細胞凋亡過程。 UNC5B 對腫瘤細胞的發(fā)生發(fā)展有著一定調控作用[6]，而UNC5B-AS1 作為UNC5B 的反義鏈， 可能也具有與UNC5B 相似的生物學功能， 可能對腫瘤的發(fā)展也有一定的影響基于此， 該研究在該院2021 年1—3 月住院并進行手術治療的膠質母細胞瘤的患者中方便收集30 例神經膠質瘤組織樣本及鄰近瘤旁組織樣本。 通過觀察對長鏈非編碼RNA UNC5B-AS1 在膠質母細胞瘤中的表達情況， 探討UNC5B-AS1 對于膠質母細胞瘤細胞增殖、侵襲和轉移的影響及作用機制，以期能夠對膠質母細胞瘤的診療過程提供幫助。現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 臨床樣本

在該院住院并進行手術治療的膠質母細胞瘤的患者中方便收集30 例神經膠質瘤組織樣本及鄰近瘤旁組織樣本。組織離體后在液氮中進行快速冷凍，在臨床樣本實驗前對其進行蘇木素-伊紅（HE）染色鑒定。該研究已經獲得倫理委員會批準，并在取樣時得到了患者許可。

1.2 細胞株

人膠質母細胞瘤細胞株購于美國ATCC 公司。

1.3 細胞培養(yǎng)與轉染

在37℃，5%CO2的條件下，在含有2.5%FBS、5%馬血清的DMEM-F12 的培養(yǎng)基中加入人膠質母細胞瘤細胞株進行培養(yǎng)，每3 天換液一次，直到細胞處于對數(shù)生長期，然后接種于6 孔板中。使用轉染效率穩(wěn)定的脂質體轉染試劑Lipofectamine2000 進行轉染，轉染48 h 時，收集細胞檢測合格后進行后續(xù)試驗。

1.4 RT-qPCR 檢測

將實驗需要的細胞組織用TRIzol 法提取總RNA， 然后按照試劑盒說明書將RNA 逆轉錄為cDNA。 在10 μl 定量PCR 反應體系條件下，其中cDNA 2 μl，2×Master Mix 0.5 μl，10 μM 的上下游引物各0.5 μl，加ddH2O 至10 μl。反應條件：95℃預變性10 min；95℃變性10 s，60℃退火60 s，40 個循環(huán)。 擴增反應結束后，95℃10 s、60℃60 s、95℃15 s，以建立PCR 產物的熔解曲線。 數(shù)據采用公式2-△△Ct方法計算。

1.5 CCK-8 檢測細胞增殖

將處于對數(shù)生長期的膠質母細胞瘤細胞株置于96 孔板中，進行轉染后培養(yǎng)48 h，然后向每個孔中加入10 μl CCK-8 試劑并進行混勻， 同時設置空白對照。 在37℃避光條件下，孵育1 h，使用酶標儀測定波長450 nm 的吸光度值。

1.6 Transwell 檢測細胞遷移和侵襲

取處于對數(shù)生長期的膠質母細胞瘤細胞株置于24 孔板中，進行轉染后培養(yǎng)48 h。 使用胰酶消化細胞株并用無血清培養(yǎng)基進行重懸， 使用臺盼藍染色技術調整細胞密度， 然后取細胞懸液100 μl 加于Transwell 小室上層向，小室下層加入500 μl 10%血清完全培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)箱中避光培養(yǎng)24 h 后取出，PBS 清洗后取出未發(fā)生遷移的細胞。 4%多聚甲醛固定20 min，充分洗滌，0.1%結晶紫染色10 min，充分洗滌后隨機分5 個視野進行計數(shù)。

將解凍好的50 μl 液態(tài)基質膠用400 μl 無血清培養(yǎng)基稀釋并搖勻， 取50 μl 的稀釋液置于Transwell 小室的上室中，在37℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待凝固后再加入100 μl 無血清培養(yǎng)基浸潤凝膠， 吸棄，后續(xù)步驟與遷移實驗操作相同， 通過計數(shù)穿模細胞數(shù)來反映細胞的侵襲能力。

1.7 流式細胞術檢測細胞凋亡

取對數(shù)生長期的膠質母細胞瘤細胞株， 將細胞接種于24 孔細胞培養(yǎng)板中，進行轉染后培養(yǎng)48 h。用不含EDTA 的0.25%胰蛋白酶消化細胞，1 000 r/min離心5 min。 PBS 磷酸鹽緩沖液漂洗細胞2 次，1 000 r/min 離心5 min， 收集細胞。 500 μl Binding buffer， 加入5 μl 的Annexin V-FITC 混勻每個樣本再加入5 μl 的PI 混勻，室溫避光孵育15 min，移入流式管中上機檢測，并進行統(tǒng)計細胞凋亡率。

1.8 Western Blot 檢測蛋白的表達

提取細胞中的總蛋白。 制備濃度為12%分離膠及5%濃縮膠的聚丙烯酰胺凝膠。 取20 μg 蛋白上樣，恒流電泳35 mA；將激活的PVDF 膜轉移緩沖液與凝膠一起置于電轉移緩沖液，在冰上且穩(wěn)壓100 V條件下轉移約2 h。 結束后， 將PVDF 膜放入TBST中洗滌充分，后置于雜交袋中（5%脫脂奶粉）室溫封閉1 h。 再次洗滌充分， 然后加入適當稀釋的抗體，4℃孵育過夜， 用TBST 洗滌2 次，15 min/次，將PVDF 膜置于1∶2 000 稀釋的HRP 標記的IgG 中，室溫放置1 h 后，用TBST 洗滌2 次，15 min/次，按ECL 顯色試劑盒說明進行發(fā)光檢測。

1.9 統(tǒng)計方法

采用SPSS 20.0 統(tǒng)計學軟件進行數(shù)據的統(tǒng)計分析，計量資料符合正態(tài)分布的以（±s）表示，不符合正態(tài)分布的用中位數(shù)和四分位數(shù)表示。 多組比較用非參數(shù)統(tǒng)計的秩和檢驗、χ2檢驗 （或Fisher精確檢驗）和配對樣本t檢驗進行分析，相關性的分析采用Spearman 檢驗，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 UNC5B-AS1 在膠質母細胞瘤組織及瘤旁組織中的表達情況

RT-qPCR 檢測結果表明， 與瘤旁組織比較，膠質母細胞瘤組織中UNC5B-AS1 的表達顯著降低，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見圖1。

2.2 UNC5B-AS1 基因對膠質母細胞瘤細胞株的生物學行為影響

在膠質母細胞瘤細胞株細胞中根據實驗分組分別進行敲除UNC5B-AS1 和過表達UNC5B-AS1 操作，通過CCK-8 實驗檢測UNC5B-AS1 對膠質母細胞瘤細胞增殖情況的影響， 結果中顯示，UNC5BAS1 對膠質母細胞瘤細胞的增殖情況無顯著影響（P＞0.05），見圖2。

流式細胞術檢測UNC5B-AS1 對膠質母細胞瘤細胞凋亡情況的實驗結果顯示，與對照組比較，敲除UNC5B-AS1 組膠質母細胞瘤細胞的凋亡率明顯明顯升高， 過表達UNC5B-AS1 組膠質母細胞瘤細胞的凋亡率明顯降低，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見圖3。敲除UNC5B-AS1 能夠促進膠質母細胞瘤細胞的凋亡， 而過表達UNC5B-AS1 能夠顯著抑制其細胞凋亡。

Transwell 檢測UNC5B-AS1 對膠質母細胞瘤細胞遷移侵襲能力實驗結果顯示，與對照組比較，敲除UNC5B-AS1 組膠質母細胞瘤細胞的遷移侵襲能力明顯明顯增加， 過表達UNC5B-AS1 組膠質母細胞瘤細胞的遷移侵襲能力明顯降低，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見圖4。 敲除UNC5B-AS1 能夠促進膠質母細胞瘤細胞的遷移侵襲，而過表達UNC5 B-AS1 能夠顯著抑制膠質母細胞瘤細胞遷移侵襲。

2.3 UNC5B-AS1 對膠質母細胞瘤中miRNAs 表達的影響

通過數(shù)據庫預測與UNC5B-AS1 結合的miRNAs，通過RT-qPCR 對膠質母細胞瘤細胞株中的預測的miRNAs 表達水平進行檢測。 通過基因干擾及過表達UNC5B-AS1 對膠質母細胞瘤細胞株進行處理，再次通過RT-qPCR 對膠質母細胞瘤細胞株中的預測的miRNAs 表達水平進行檢測，結果顯示，干擾UNC5B-AS1 組miRNAs 的表達水平為（1.12±0.11），過表達UNC5B-AS1 組miRNAs 的表達水平為（0.40±0.03），對照組為（0.80±0.34），差異有統(tǒng)計學意義 （F=11.298，P=0.004）， 與對照組比較， 過表達UNC5B-AS1 組細胞中miRNAs 的表達水平明顯降低（P＜0.05），而干擾UNC5B-AS1 組細胞中miRNAs的表達水平無明顯變化（P＞0.05），見圖5。

3 討論

膠質母細胞瘤的治療很難依靠手術徹底摘除，以致其治療的復發(fā)率高、治愈率低[7]，神經系統(tǒng)的檢查則有利于判斷腫瘤影響哪些腦部區(qū)域[8]。后續(xù)在宮頸癌、食管鱗狀細胞癌、膠質瘤細胞等的研究中發(fā)揮重要作用[9-10]。 lncRNA 與mRNA 之間形成的競爭性調控網絡，在膠質母細胞瘤的增殖、轉移、凋亡等過程中發(fā)揮著重要的調節(jié)作用[11-12]。

該研究中發(fā)現(xiàn)，膠質母細胞瘤組織中UNC5B-AS1的表達較瘤旁組織顯著降低（P＞0.05）；CCK-8 實驗檢測結果UNC5B-AS1 對膠質母細胞瘤細胞的增殖情況無顯著影響（P＞0.05）；流式細胞術檢測結果，與對照組比較， 敲除UNC5B-AS1 組膠質母細胞瘤細胞的凋亡率明顯明顯升高， 過表達UNC5B-AS1 組膠質母細胞瘤細胞的凋亡率明顯降低 （P＜0.05）；Transwell 檢測結果， 與對照組比較， 敲除UNC5BAS1 組膠質母細胞瘤細胞的遷移侵襲能力明顯增加， 過表達UNC5B-AS1 組膠質母細胞瘤細胞的遷移侵襲能力明顯降低（P＜0.05）。 葛維等[13]研究顯示，UNC5B-AS1 對胃癌細胞的增殖無明顯影響，過表達能夠顯著抑制胃癌細胞的遷移能力。 有研究表明，lncRNA UNC5B-AS1 在卵巢癌細胞中呈高表達狀態(tài)，下調其表達抑制卵巢癌細胞的增殖，促進其凋亡[14]，發(fā)現(xiàn)其在結腸癌中高表達，而沉默其表達則抑制結腸癌細胞的增殖、 遷移侵襲能力， 促進其凋亡[15]。lncRNA UNC5B-AS1 在胃癌組織中含量增高，抑制其表達可以抑制胃癌AGS 細胞的增殖，促進AGS細胞的凋亡[16]。 該研究中l(wèi)ncRNA UNC5B-AS1 對膠質母細胞瘤細胞的增殖影響不是很顯著， 與上述研究結果不一致， 可能與實驗所選取瘤細胞的分期不同， 這些數(shù)據表示明UNC5B-AS1 可作為膠質母細胞瘤發(fā)生發(fā)展過程中的關鍵性因素， 并且調控膠質母細胞瘤細胞的增殖、凋亡及遷移侵襲能力。

lncRNA 能夠選擇性地吸附miRNA 調控腫瘤的發(fā)生發(fā)展[17]，UNC5B-AS1 能夠負向調控miR-128-5p 的表達，促進肺癌A549 細胞的黏附、侵襲和遷移[18]。 該研究中，通過數(shù)據庫預測與UNC5BAS1 結合的miRNAs， 通過RT-qPCR 對膠質母細胞瘤細胞株中的預測的miRNAs 表達水平進行檢測中發(fā)現(xiàn)，與對照組比較，過表達UNC5B-AS1 組細胞中miRNAs 的表達水平明顯降低 （P＜0.05）， 而干擾UNC5B-AS1 組細胞中miRNAs 的表達水平無明顯變化（P＞0.05），由此可知，UNC5B-AS1 能夠負向調控miRNAs 的表達。 根據UNC5B-AS1 在膠質母細胞瘤組織中低表達， 以及UNC5B-AS1 對膠質母細胞瘤細胞凋亡、 遷移侵襲能力的作用， 可以推測UNC5B-AS1 可能一個抑癌基因，可以作為膠質母細胞瘤診斷的標記性因子，為臨床診斷提供理論依據。