枸杞多糖的提取及其體外抗氧化活性

劉鵬，李達(dá)，紀(jì)海玉，賈曉昱，田凌

（1.天津現(xiàn)代職業(yè)技術(shù)學(xué)院生物工程學(xué)院，天津 300451；2.天津科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，天津 300457；3.天津市農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品保鮮與加工技術(shù)研究所，天津 300384；4.唐山市盛川農(nóng)產(chǎn)品股份有限公司，河北 唐山 064105）

枸杞（Fructus Lycii）是我國(guó)傳統(tǒng)的名貴中藥材和重要經(jīng)濟(jì)作物，其營(yíng)養(yǎng)豐富品種繁多，許多以枸杞子為基礎(chǔ)材料的產(chǎn)品已被陸續(xù)開(kāi)發(fā)出來(lái)，如枸杞酒、枸杞多糖、枸杞粉、枸杞濃縮原汁等[1]。枸杞多糖（Fructus Lycii polysaccharide，F(xiàn)LP）是一種具有水溶性的多糖成分，且是枸杞中重要的功能性成分。目前已有研究對(duì)枸杞中的多糖進(jìn)行分離和純化[2-3]，并對(duì)其在調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能、增強(qiáng)記憶力、抗腫瘤、抗癌、降血脂等方面的作用進(jìn)行測(cè)定[4-6]。然而，針對(duì)枸杞多糖的抗氧化功能，從體外組織水平，綜合驗(yàn)證其對(duì)機(jī)體重要組織的抗氧化能力的研究較少，不利于其功能性食品的綜合開(kāi)發(fā)。因此，本文在對(duì)FLP進(jìn)行分離以及純化的基礎(chǔ)上，確定了其單糖成分，并研究了其粗提物和純化品的體外抗氧化活性，從而為枸杞多糖功能性食品的開(kāi)發(fā)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

枸杞：市售；鼠李糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、半乳糖、葡萄糖單糖標(biāo)準(zhǔn)品（均為色譜純）：上海源葉生物科技有限公司；超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）檢測(cè)試劑盒，丙二醛（malondialdehyde，MDA）檢測(cè)生化試劑盒：南京建成生物工程研究所；吩嗪硫酸甲酯（分析純）、2，2-聯(lián)苯基-1-苦基肼基（2，2-Diphenyl-1-picrylhydrazyl，DPPH，分析純）：上海阿拉丁生化科技股份有限公司；硫代巴比妥酸（分析純）：中國(guó)醫(yī)藥（集團(tuán)）上海化學(xué)試劑公司；抗壞血酸（分析純）：天津大茂化學(xué)試劑廠。

ICR小白鼠[清潔級(jí)，10～12周齡，雌性小鼠，體重（28±2）g]：北京維通利華試驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

高效液相氣相色譜儀（GC-2010 Pro）：日本島津公司；高速冷凍離心機(jī)（5804r）：德國(guó)艾本德股份公司；紫外分光光度計(jì)（T6新世紀(jì)）：北京普析通用儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 枸杞多糖（FLP）的制備

1.3.1.1 枸杞粗多糖的提取

根據(jù)劉銳等[7]的方法，枸杞于烘箱中55℃干燥12h后，打漿機(jī)粉碎，定量稱(chēng)取枸杞干粉 20 g，按 1∶5（g/mL）比例加入蒸餾水，在90℃下提取4 h，離心后收集上清液，將收集到的上清液再進(jìn)行抽濾后棄去殘?jiān)Ｕ婵諠饪s至50 mL后加入無(wú)水乙醇180 mL，沉淀14 h后抽濾，濾渣回流浸提1 h，取沉淀，再重復(fù)浸提，直到沉淀變?yōu)榘咨玫酱侄嗵菢悠贰?/p>

1.3.1.2 糖蛋白脫除

依據(jù)繆風(fēng)等[3]的方法將粗多糖用蒸餾水復(fù)溶，Sevage法脫蛋白。

1.3.1.3 多糖的純化分級(jí)

根據(jù)Kumaran等[8]的方法，采用DEAE-cellulose-32（φ25 mm×450 mm）預(yù)處理后色譜柱層析對(duì)枸杞多糖進(jìn)行純化分離，取1.00 g脫蛋白多糖，溶于100 mL蒸餾水中，完全溶解后上柱吸附，以梯度洗脫法洗脫各級(jí)分，洗脫液分別為超純水、0.05、0.10、0.25 mol/L NaCl，流速控制為12滴/min，用自動(dòng)部分收集器收集洗脫液，每5 min 1管，每管3 mL，共收集150管，將收集到的樣品溶液分別在280 nm波長(zhǎng)下比色，并通過(guò)苯酚-硫酸法測(cè)定多糖，以洗脫管數(shù)以及測(cè)定的吸光度分別為橫縱坐標(biāo)可得出梯度洗脫曲線(xiàn)，色譜柱將枸杞多糖洗脫為4個(gè)組分，得到枸杞多糖純化品FLP1～4。

1.3.2 測(cè)定FLP各組分的單糖組成

參考Altintas等[9]方法，精密稱(chēng)取5 mg純化品多糖于安瓿瓶中，加入5mL的硫酸（2mol/L），充入氮?dú)猓碴称糠饪诤螅糜?00℃恒溫電烘箱中水解8 h。室溫冷卻后，加入研磨好的BaCO3粉末至中性，于4 000 r/min離心15 min，收集上清液，減壓蒸干水解產(chǎn)物。量取5 mg單糖混合標(biāo)準(zhǔn)品和水解后的多糖樣品溶液置于離心管中，加入5mg鹽酸羥胺和0.5mL吡啶，于95℃水浴30 min后，加0.5 mL醋酸酐再于95℃水浴30 min，冷卻后，減壓蒸干，加1 mL蒸餾水溶解，用1 mL氯仿萃取，重復(fù)3次，合并氯仿層，蒸干，最后加0.5 mL氯仿溶解，過(guò)0.45 μm微孔濾膜后，備用。HP-5毛細(xì)管色譜柱（30 m×0.32 mm×0.25 μm），高純氮為載氣，分壓80 kPa；氫火焰離子化檢測(cè)器，溫度250℃；進(jìn)樣口溫度250℃。升溫程序：初溫150℃，保留1 min，以10℃/min升溫至200℃，保留10 min，繼續(xù)以5℃/min升溫至220℃，保留5 min，最后以1.5℃/min升溫至終溫240℃，并保留20 min。

1.3.3 DPPH自由基清除率的測(cè)定

參考孫玉姣等[10]的方法，分別量取不同質(zhì)量濃度的枸杞多糖粗制品和純化品1 mL，隨后再分別放進(jìn)0.004%DPPH配制的甲醇溶液3 mL，搖勻，遮光擱置20 min，選用甲醇液為空白比對(duì)液，在517 nm處檢測(cè)吸光度值，選用蒸餾水為陰性比對(duì)液，選用VC溶液為陽(yáng)性比對(duì)液。

1.3.4 超氧陰離子自由基（O2-·）清除率的測(cè)定

參考張鳳培等[11]的方法，對(duì)照組用不相同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的枸杞多糖粗制品和純化品1 mL，吩嗪硫酸甲酯溶液則被0.4 mL蒸餾水代替作為空白，選蒸餾水為陰性對(duì)比，VC溶液為陽(yáng)性對(duì)比。

1.3.5 羥自由基（·OH）清除作用的測(cè)定

參考Yang等[12]方法，分別量取不同濃度的枸杞多糖粗制品和純化品1 mL，再按次序滴進(jìn)1.5 mL反應(yīng)液 [含0.1 mmol/L乙二胺四乙酸、0.1 mmol/L FeCl3和2.8 mmol/L氯化鈉的磷酸鹽緩沖液（pH7.4）]和0.35 mL H2O2（20 mmol/L），在37℃水浴下反應(yīng)40 min后停止，在532 nm處檢測(cè)吸光度值，選用蒸餾水為陰性對(duì)比，VC為陽(yáng)性對(duì)比。

1.3.6 FLP對(duì)機(jī)體重要組織抗氧化能力的影響

10%組織勻漿液制備：ICR小白鼠頸椎脫臼處死，解剖獲得小鼠肝臟組織、腦組織和心臟組織，預(yù)冷生理鹽水沖洗，濾紙吸干，稱(chēng)重。制備10%組織勻漿液。SOD活力和MDA含量依照試劑盒說(shuō)明書(shū)測(cè)定。

2 結(jié)果與分析

2.1 DEAE-cellulose-32色譜柱對(duì)枸杞多糖的分離效果

用色譜柱對(duì)枸杞多糖進(jìn)行洗脫，洗脫效果如圖1所示。

圖1 FLP在DEAE-cellulose-32色譜柱上的洗脫曲線(xiàn)Fig.1 Elution curve of FLP on DEAE-cellulose-32 column

由圖1可知，色譜柱將枸杞多糖洗脫為4個(gè)組分，分別表示為FLP1～FLP4。

2.2 FLP各組分單糖成分分析

氣相色譜法對(duì)4組多糖的單糖組成的分析結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2 FLP及其各組分氣相色譜Fig.2 Gas chromatograms of FLP and FLP components

由試驗(yàn)可知枸杞多糖中含有鼠李糖、阿拉伯糖、葡萄糖、半乳糖、木糖和甘露糖，與文獻(xiàn)中研究的枸杞類(lèi)多糖的單糖組成一致[13-16]，純化后各組分的糖含量發(fā)生了變化。其中，F(xiàn)LP-2中木糖及半乳糖含量較多。與FLP-2相比，F(xiàn)LP-3、FLP-4中木糖含量依次減少，其余單糖含量未呈現(xiàn)規(guī)律性變化。

2.3 枸杞多糖清除DPPH·的能力

以VC對(duì)DPPH·的清除率作為對(duì)比，測(cè)定枸杞多糖粗制品以及純化品對(duì)DPPH·的清除效果，結(jié)果如圖3所示。

圖3 FLP對(duì)DPPH·的清除率Fig.3 DPPH free radical scavenging rate of FLP

DPPH·的獨(dú)對(duì)電子在517 nm附近有強(qiáng)吸收峰，并且由于其性質(zhì)非常穩(wěn)定常被用來(lái)作為測(cè)試底物，對(duì)其清除率的測(cè)定能夠評(píng)價(jià)自由基清除劑的抗氧化活性[17]。結(jié)果表明，隨著多糖質(zhì)量濃度的增加，其抗氧化活性逐漸增強(qiáng)，且純化品對(duì)DPPH·的抑制作用強(qiáng)于粗制品。

2.4 枸杞多糖清除O2-·的能力

以VC對(duì)O2-·的清除率作為對(duì)比，測(cè)定枸杞多糖粗制品以及純化品對(duì)O2-·的清除效果，結(jié)果如圖4所示。

圖4 FLP對(duì)超氧陰離子自由基清除率Fig.4 Superoxide anion free radical scavenging rate of FLP

對(duì)O2-·的清除能力，是衡量活性物質(zhì)抗氧化能力的重要指標(biāo)。O2-·在機(jī)體內(nèi)可以形成氧化性較強(qiáng)且能裂解為單線(xiàn)態(tài)氧自由基或羥基自由基，使DNA的單股鏈開(kāi)裂，從而對(duì)生物體形成損害[18]。枸杞多糖具有一定的清除O2-·的能力，且具有一定的質(zhì)量濃度依賴(lài)性，并且，純化品的O2-·清除能力優(yōu)于粗制品。

2.5 枸杞多糖清除·OH的能力

以VC對(duì)·OH的清除率作為對(duì)比，測(cè)定枸杞多糖粗制品以及純化品對(duì)·OH的清除效果，結(jié)果如圖5所示。

圖5 FLP對(duì)羥自由基清除率Fig.5 Hydroxyl free radical scavenging rate of FLP

羥自由基是機(jī)體內(nèi)較為活潑的自由基，其清除率對(duì)于評(píng)價(jià)活性物質(zhì)的抗氧化活性具有重要的意義，結(jié)果表明，隨著質(zhì)量濃度的增加，枸杞多糖抑制·OH的效果逐漸增強(qiáng)，且純化品的清除作用優(yōu)于粗制品，當(dāng)質(zhì)量分?jǐn)?shù)是1.0 mg/mL時(shí)，純化品的·OH清除率明顯高于粗制品。

2.6 FLP對(duì)機(jī)體重要組織抗氧化能力的影響

機(jī)體的心臟、腦及肝臟是重要的功能性器官，在衰老過(guò)程中，這些組織的抗氧化能力體現(xiàn)了衰老的進(jìn)程和程度[19-21]。因此，在體外組織水平的試驗(yàn)研究中，主要關(guān)注這些組織在枸杞多糖和VC存在環(huán)境下，其SOD的活力以及指征非酶系抗氧化能力的脂質(zhì)過(guò)氧化程度的MDA含量。

2.6.1 FLP在體外對(duì)小鼠心臟、腦、肝臟組織SOD活力的影響

以VC作為對(duì)比，測(cè)定枸杞多糖純化品對(duì)小鼠心臟組織SOD活力的影響，結(jié)果如圖6所示。

圖6 FLP在體外對(duì)小鼠心臟組織中SOD活力的影響Fig.6 The effect of FLP on SOD activity in mouse heart tissue in vitro

SOD是機(jī)體內(nèi)抗氧化酶類(lèi)中的代表之一，其酶活力的高低對(duì)衡量活性物質(zhì)的抗氧化能力具有重要的意義。由圖6顯示的試驗(yàn)結(jié)果可知，VC在較高濃度水平下可以提高小鼠心臟組織SOD活力，而隨FLP濃度升高，小鼠心臟組織中SOD的活力呈現(xiàn)先升高后降低趨勢(shì)。該結(jié)果顯示低濃度的FLP與小鼠心臟組織中SOD活力沒(méi)有明顯的對(duì)應(yīng)關(guān)系，并且當(dāng)濃度升高為4.000 mg/mL，SOD活力反而有所下降。

SOD在腦抗氧化酶系統(tǒng)中有著重要的作用，F(xiàn)LP對(duì)小鼠腦組織中SOD活力的影響如圖7所示。

圖7 FLP在體外對(duì)小鼠腦組織中SOD活力的影響Fig.7 The effect of FLP on SOD activity in mouse brain tissue in vitro

圖7結(jié)果表明，VC對(duì)小鼠腦組織中SOD的活力有促進(jìn)作用，并且在濃度為4.000 mg/mL時(shí)達(dá)到最大。而在FLP樣品液濃度較高（4.000 mg/mL）時(shí)，腦組織中SOD活力降低。

SOD在肝臟的抗氧化酶系統(tǒng)中重要的組分，F(xiàn)LP對(duì)小鼠肝臟組織中SOD活力的影響如圖8所示。

圖8 FLP在體外對(duì)小鼠肝臟組織中SOD活力的影響Fig.8 The effect of FLP on SOD activity in mouse liver tissue in vitro

結(jié)果表明，在FLP樣品液濃度較高（4.000 mg/mL）時(shí)，肝臟組織中SOD活力降低，并有隨FLP樣品液濃度升高，SOD活力降低的變化趨勢(shì)。

綜合體外組織水平的試驗(yàn)研究結(jié)果，隨著樣液濃度升高，SOD活力呈現(xiàn)不同變化趨勢(shì)，F(xiàn)LP在心臟、腦和肝臟組織勻漿中的SOD的活力均呈現(xiàn)出伴隨FLP樣品液濃度升高而降低的趨勢(shì)。

2.6.2 FLP在體外對(duì)小鼠心臟、腦、肝臟組織脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)的影響

丙二醛（MDA）含量能夠有效地反映小鼠心臟、腦、肝臟組織脂質(zhì)過(guò)氧化的程度，以VC作為對(duì)比，考察了枸杞多糖純化品對(duì)小鼠心臟、腦和肝臟組織MDA含量的影響，結(jié)果如圖9～圖11所示。

圖9 FLP在體外對(duì)小鼠心臟組織中MDA含量的影響Fig.9 The effect of FLP on the MDA content in mouse heart tissue in vitro

圖10 FLP在體外對(duì)小鼠腦組織中MDA含量的影響Fig.10 The effect of FLP on the MDA content in mouse brain tissue in vitro

圖11 FLP在體外對(duì)小鼠肝組織中MDA含量的影響Fig.11 The effect of FLP on the MDA content in mouse liver tissue in vitro

FLP對(duì)小鼠心臟組織的脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)影響不大，對(duì)腦組織的脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物丙二醛生成有抑制作用。對(duì)于肝組織的脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)具有一定抑制效果，并在試驗(yàn)濃度范圍內(nèi)呈現(xiàn)劑效關(guān)系。

通過(guò)上述對(duì)于小鼠心臟、腦、肝臟體外組織和細(xì)胞水平的抗氧化試驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)LP能夠降低MDA的質(zhì)量濃度，不能增強(qiáng)SOD活力，但卻能在一定程度上抑制發(fā)生在細(xì)胞和組織水平的脂質(zhì)過(guò)氧化，具有一定的抗氧化作用。

3 結(jié)論

本文對(duì)枸杞多糖進(jìn)行分離純化，制得其粗制品和純化品，測(cè)定了純化品的單糖組成，檢驗(yàn)了其對(duì)DPPH·、O2-·和·OH的清除能力并利用小鼠心臟、腦和肝臟組織進(jìn)行了體外抗氧化活性試驗(yàn)。研究表明，F(xiàn)LP的純化品的抗氧化能力明顯優(yōu)于粗制品，且其對(duì)DPPH·、O2-·和·OH等自由基的清除能力呈劑量依賴(lài)型變化。在體外抗氧化試驗(yàn)中，F(xiàn)LP能夠降低MDA含量，抑制發(fā)生在細(xì)胞和組織水平的脂質(zhì)過(guò)氧化，具有抗氧化作用。與VC的對(duì)照試驗(yàn)表明，枸杞多糖雖然是一種有效的抗氧化劑，但其抗氧化性弱于VC。