響應面法優化棗渣總三萜提取工藝及其抗氧化、抗增殖活性

陳楠，吳瀟霞，白冰瑤，陳計巒*

（1.石河子大學食品學院，新疆 石河子 832000；2.塔里木大學生命科學學院，新疆 阿拉爾 843300）

紅棗原產于中國，距今已有4 000多年的歷史[1]。我國紅棗種植面積較廣，產量居世界第一[2]，主要分布于新疆、河北和陜西等地。新疆由于降雨量少，日照充足，有利于紅棗中糖分的積累[3-4]。紅棗具有較高的營養價值和藥用價值[5]，其不僅有較強的抗氧化能力[2]，還具有抗癌、保肝護肝、美容養顏等功效[6]。許多研究表明，紅棗具有多種功效的原因是棗肉和棗皮中含有多種化學成分，包括三萜類化合物、多酚、礦物質、氨基酸和多糖等[7]。

目前，國內外對紅棗的研究主要集中于多糖等功能成分的提取分析，對紅棗中總三萜的提取及抗氧化和抗增殖活性報道較少。三萜類化合物具有良好的抗腫瘤作用[8]，可應用于食品或制藥行業中[9]，提高紅棗產業經濟效益[10]。

棗渣是三萜類化合物的良好來源[11]，但在紅棗加工過程中常被當作廢棄物直接丟棄或掩埋，這種處理方式不僅會造成三萜類化合物的浪費，還會造成環境污染[12-13]。因此，為了提高棗渣的利用率，充分挖掘其潛在價值，本試驗將超聲輔助技術應用于棗渣總三萜的提取，并通過響應面法對棗渣中總三萜的提取條件進行優化并研究其抗氧化和抗增殖活性，為棗渣的深度利用提供參考依據，提高廢物資源利用率。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與設備

1.1.1 棗渣的制備

棗（Ziziphus jujuba Mill.cv.Junzao）：市售。棗用去離子水清洗后，去核，搗碎，分離棗渣并凍干，-18℃保存，以備進一步試驗。

1.1.2 試劑

2，2'-偶氮-雙（3-乙基苯并噻唑-6）磺酸（2'-azinobis-3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonate，ABTS）、2，2-二苯基-1 苦基肼 （1，1-diphenyl-2-picryl Hydrazyl，DPPH）、抗壞血酸：北京索萊寶有限公司；齊墩果酸、熊果酸、白樺脂酸、麥珠子酸、山楂酸：上海安普實驗技術有限公司；RPMI 1640培養基：美國GIBCO公司；二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）：美國 Sigma-Aldrich公司。

1.1.3 儀器與設備

XS-O4多功能粉碎機：上海兆中科技有限公司；DZKW-D2恒溫水浴鍋：北京市永光明醫療儀器廠；BGZ-246電熱鼓風干燥機：上海博迅實業有限公司；超聲清洗槽（SK5200GT）：上海科道儀器有限公司;TDL-4A低速多管大容量離心機：上海非恰爾分析儀器有限公司；搖床（SHZ-A）：常州諾佳儀器有限公司；JO-060S超聲波清洗機：深圳市潔盟清洗設備有限公司；LE-203E電子天平：梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；J6紫外可見分光光度計：上海儀電分析儀器有限公司；Synergy H1多功能酶標儀：美國博騰儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 超聲輔助提取（ultrasonic-assisted extraction，UAE）

精密稱取一定量紅棗渣凍干粉，置于錐形瓶中，分別設置不同提取溫度、提取時間、液固比和乙醇濃度對棗渣樣品（2.5 g）中的三萜進行超聲輔助提取，收集濾液，并用相同體積的溶劑重復萃取（2個循環），合并濾液，濃縮并冷凍干燥。

1.2.2 常規振動提取（conventional vibrate extraction，CVE）

將樣品（2.5 g）與 85 mL乙醇（64%，體積分數）混合并放置在錐形瓶中，然后使用搖床進行輔助提取。提取溫度60℃，轉速260 r/min，持續72 min，離心收集上清液，濃縮并凍干。

1.2.3 單因素試驗

分別稱取棗渣粉末 2.5 g，設置液固比 35∶1（mL/g），乙醇濃度60%（體積分數），超聲溫度50℃，考察超聲時間分別為 20、30、40、50、60 min 時對總三萜含量（total triterpene content，TTC）的影響；設置超聲時間40 min，溫度 50 ℃，液固比 35∶1（mL/g），考察乙醇濃度分別為40%、50%、60%、70%、80%時對總三萜含量的影響；設置液固比 35∶1（mL/g），超聲時間 40 min，乙醇濃度 60%，考察超聲溫度分別為 40、50、60、70、80℃時對總三萜的影響；設置乙醇濃度60%，超聲溫度50℃，超聲時間 40 min，考察液固比分別為 25∶1、30∶1、35∶1、40∶1、45∶1（mL/g）時對總三萜含量的影響。

1.2.4 響應面優化試驗

在單因素試驗的基礎上，進行Box-Behnken響應面試驗設計[14]。對4個影響因素進行四因素三水平試驗，以總三萜含量作為響應值，探究棗渣總三萜的最佳提取工藝條件。利用Design-Expert V8.0.6軟件進行分析，建立數學回歸模型，以得到最佳提取工藝，響應面因素與水平見表1。

表1 響應面試驗因素與水平Table 1 Factors and levels of response surface methodology

1.2.5 總三萜含量的測定

1.2.5.1 標準曲線的繪制

參照文獻[15]繪制標準曲線，得到的線性回歸方程為y=25.296x-0.011，相關系數R2=0.999 3。

1.2.5.2 樣品總三萜含量的測定

準確稱量50.0 mg齊墩果酸標準品，用60%乙醇溶液溶解，定容至50 mL，配制成1 mg/mL的標準溶液。取 0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mL 的標準溶液于具塞試管中，100℃水浴揮干，依次加入5%香草醛-冰乙酸0.4 mL，高氯酸 1.6 mL[16]。65℃水浴加熱 45 min，冷卻至室溫，用冰乙酸定容至10.0 mL，搖勻后靜置15 min。以0管為對照溶液，在548 nm處測其吸光值，按照式（1）計算總三萜含量。

式中：W為提取率，mg/g；c為計算的總三萜濃度，mg/mL；n為稀釋倍數；v為樣品溶液體積，mL；m為樣品質量，g

1.2.6 棗渣總三萜提取物的抗氧化評價

1.2.6.1 DPPH自由基清除能力

參考文獻[17]的方法，分別準確吸取不同濃度待測樣品2 mL，再吸取2 mL DPPH標準乙醇溶液加入到10 mL的試管中搖勻，室溫（25℃）避光30 min后在517 nm處測定吸光值。重復3次，取平均值。DPPH自由基清除能力按公式（2）計算。

式中：A0為DPPH溶液的吸光度；A1為被測樣品存在時的吸光度。

1.2.6.2 ABTS+自由基清除能力

參考文獻[18]略有改動，配制ABTS工作液，分別取工作液0.5 mL于試管中，依次加入不同濃度的樣品溶液（濃度由低到高）0.5 mL，充分混合后反應6 min，在734 nm波長處測其吸光值。按公式（3）計算ABTS+自由基的清除能力。

式中：A1為樣品吸光度；A0為空白樣品吸光度。

1.2.6.3 羥基自由基清除能力

羥基自由基的清除能力按照文獻[19]進行測定。樣品配制濃度分別為 0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/mL，然后各取1.0 mL分別與2 mL 9 mmol/L硫酸亞鐵溶液和2 mL 9 mmol/L水楊酸乙醇溶液混合。混合均勻后，加入1 mL 9 mmol/L過氧化氫溶液，37℃靜置30 min，在510 nm處測定吸光值。羥基自由基清除能力按公式（4）計算。

式中：A2為樣品吸光度；A0為空白樣品吸光度；A1為超純水代替雙氧水的吸光度。

1.2.7 抗增殖活性

采用cell counting kit-8（CCK-8）試驗評價棗渣總三萜抗增殖效果。A549細胞于RPMI 1640培養基中，溫度37℃，5% CO2條件下培養。細胞（2×104Cells/mL）在96孔組織培養板中培養24 h，用20 μL樣品（濃度為 0、0.1、0.5、1.0 mg/mL）在溶劑（0.1% DMSO）中處理48 h[20]。每個濃度試驗重復3次。抑制率按公式（5）計算。

式中：A0為對照品的吸光度；A1為樣品的吸光度。

1.2.8 掃描電鏡（scanning electron microscope，SEM）分析

對干燥后的樣品表面進行真空噴金濺射，用掃描電子顯微鏡在15 kV加速電壓下測定凍干棗渣樣品的微觀結構。

1.3 數據處理

運用Design-Expert V8.0.6進行響應面優化處理，采用Origin2019b軟件進行數據分析并繪圖。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果

2.1.1 超聲溫度對總三萜含量的影響

超聲溫度對總三萜含量的影響見圖1。

圖1 超聲溫度對總三萜含量的影響Fig.1 Effect of ultrasonic temperature on total triterpenoid content

由圖1可以得出，總三萜得率隨著超聲溫度的增大而不斷增大，50℃時得率最高，為15.7 mg/g，繼續升高溫度至80℃過程中，總三萜含量逐漸下降。在一定范圍內，提高超聲波溫度有利于三萜類化合物的浸出，但過高的溫度會降低三萜類化合物的穩定性，加速破壞三萜類化合物[21]。還有一方面原因是溫度較高，溶劑揮發嚴重，其它物質也會隨之溶出[22]。故選取超聲溫度為50℃最合適。

2.1.2 超聲時間對總三萜含量的影響

超聲時間對總三萜含量的影響見圖2。

圖2 超聲時間對總三萜含量的影響Fig.2 Effect of ultrasonic time on total triterpenoid content

由圖2可知，在超聲時間從20 min增加至40 min的過程中，總三萜含量不斷增大，可能的原因是隨著時間的增加使得溶質和乙醇充分接觸，三萜的提取率升高[23]；當提取時間為40 min時，總三萜提取率最大，為15 mg/g；之后，隨著超聲時間逐漸增加至60 min，提取率緩慢下降，原因是細胞內外濃度達到平衡[24]，待析出物質減少，提取速率降低[23]。

2.1.3 液固比對總三萜含量的影響

液固比對總三萜含量的影響見圖3。

圖3 液固比對總三萜含量的影響Fig.3 Effect of liquid-to-solid ratio on total triterpenoid content

如圖 3 所示，當液固比在 25∶1（mL/g）～35∶1（mL/g）時，總三萜含量隨著液固比的增大而增大，原因是一定范圍內溶劑量的增大使得三萜類物質能更好地釋放[25]，但當液固比大于 35∶1（mL/g）時，總三萜含量開始降低，可能的原因是溶劑用量增大，超聲波與棗渣粉之間作用減弱，導致總三萜得率下降[26]。考慮提取率及經濟效益，選取最佳液固比為 35∶1（mL/g）。

2.1.4 乙醇濃度對總三萜含量的影響

乙醇濃度對總三萜的影響見圖4。

圖4 乙醇濃度對總三萜含量的影響Fig.4 Effect of ethanol concentration on total triterpenoid content

由圖4可知，乙酸濃度為40%～60%時，隨著乙醇濃度的增大，總三萜含量不斷增大；當乙醇濃度為60%時，總三萜得率最大，為14 mg/g；乙醇濃度繼續增大時，總三萜含量開始下降，可能的原因是色素及親脂性強的成分溶出，從而導致棗渣總三萜的含量降低[27]。其次，總三萜通常以苷或苷元存在，苷易溶于水，苷元易溶于醇，乙醇濃度過高或過低都不利于二者的充分提取[28]。

2.2 響應面試驗結果與分析

2.2.1 響應面設計結果

響應面試驗能夠考察多因子之間的影響，得到的三維立體圖形在反映因變量變化程度的同時，通過自變量的相互影響確定因變量的最佳條件。本試驗中，利用響應面軟件Design-Expert V8.0.6設計四因素三水平的試驗，設計方案與結果見表2，回歸模型方差分析見表3。

表2 棗渣中TTC提取的響應面試驗設計與結果Table 2 Response surface design and results of extraction of total triterpenoids from jujube residue

表3 棗渣TTC的二次模型方差分析結果Table 3 Analysis of variance（ANOVA）for quadratic models on total triterpenoids of jujube residue

如表2所示，棗渣提取物的TTC為8.400 mg/g～15.580mg/g，對數據進行回歸擬合得到TTC含量的二階多項式方程：Y=12.65-1.31X1-0.11X2-0.053X3-0.30X4-0.81X1X2-0.30X1X3-0.81X1X4-0.30X2X3-0.90X2X4+0.66X3X4+0.88X12-1.67X22-1.27X32-1.11X42。

采用方差分析和決定系數（R2）來檢驗TTC的響應面法模型的充分性。表3顯著性結果表明，總三萜含量的回歸模型差異為極顯著（P＜0.000 1），總三萜含量與X1（溫度）、X3（液固比）2個因素之間的線性關系極顯著，回歸模型的失擬項為0.160 9，不顯著（P＞0.05）。模型的校正決定系數為0.956 6，說明有4.34%的情況不能以此模型進行解釋，相關系數為0.978 3，綜上，該模型與實際試驗擬合程度較高，可以較為合理地表述響應值和4個因素之間存在的線性關系。因此，該回歸方程適用于此模型。在此試驗中，還可以通過各因素F值來推斷該因素對試驗結果的重要性，因素的F值越大，則對該模型結果影響也越大。由表3可知，各因素對試驗結果的影響大小依次為X1＞X4＞X2＞X3，即超聲溫度＞乙醇濃度＞超聲時間＞液固比。

2.2.2 響應面的分析及優化

圖5表示各因素交互作用對總三萜含量的影響，隨著各變量的增加，總三萜含量呈現先增大后逐漸減小的變化趨勢，說明這些變量的交互作用對總三萜含量的影響也比較大，有相關研究表明，液固比和乙醇濃度是影響響應面法提取三萜類化合物最佳工藝條件的重要因素[29]。除此之外，等高線的圖形均為橢圓形，說明各變量的交互作用顯著[30]。

圖5 超聲時間、液固比和乙醇濃度對TTC影響的響應面圖和等高線圖Fig.5 Surface plot and contour plot of the effects of ultrasonic time，liquid-to-solid ratio，and ethanol concentration on total triterpenoid content

2.2.3 模型驗證

響應面模型優化的最佳工藝為超聲溫度60℃，超聲時間 42.04 min，液固比 34.34∶1（mL/g），乙醇濃度63.35%，為了便于工業操作，確定的最終工藝為超聲溫度 60 ℃，超聲時間 42 min，液固比 34∶1（mL/g），乙醇濃度64%，此條件下總三萜得率為15.854 mg/g，與模型預測值的相對誤差（15.799 mg/g）為0.35%。因此，該優化提取條件是可行的，具有實際應用價值。

2.3 抗氧化試驗結果

棗渣總三萜提取物抗氧化試驗結果見圖6。

圖6 棗渣總三萜提取物體外抗氧化活性Fig.6 Antioxidant activity of total triterpenoid extract from jujube residue in vitro

由圖6可知，通過DPPH、ABTS+和羥基自由基清除活性測試，UAE提取物的IC50值分別為0.702、0.203、0.596 mg/mL，CVE 提取 物的 IC50值分別為1.000、0.665、1.043 mg/mL。在本研究中，UAE 提取物的抗氧化能力明顯高于CVE提取物，這可能是紅棗渣中富含三萜類化合物，由于超聲波的作用使其更大程度地釋放，具有更好的自由基清除活性[31-32]。此外，有報道表明酚酸中的沒食子酸也具有較強的抗氧化性能[33]。

2.4 抗A549細胞增殖試驗結果

CVE和UAE提取物對A549癌細胞增殖的影響結果見表4。

表4 棗渣中三萜類對A549癌細胞增殖的影響Table 4 Effect of jujube residue extract on proliferation of A549 cancer cells

如表4所示，不同濃度提取物對A549細胞的增殖率均有不同程度的抑制作用，且抑制率隨提取物濃度的增加而增加。當濃度為1 mg/mL時，CVE和UAE的抑制率分別為27.18%和37.62%，UAE提取物的抑制率僅次于VC。相關研究表明，含有乙酰基的三萜類化合物能夠有效抑制A549癌細胞的增殖[20]。

2.5 SEM分析

原樣及兩種方式提取三萜類化合物后棗渣掃描電鏡圖見圖7。

圖7 棗渣掃描電鏡圖Fig.7 Scanning electron microscope photos of jujube residue

由圖7發現，不同處理方法下棗渣的微觀結構有顯著差異。未處理的樣品表面光滑且密度大（圖7a）。CVE處理的（圖7b）棗渣微觀結構相對均勻，細胞壁受損較少；超聲波預處理則導致細胞產生大量的缺口，細胞壁破壞嚴重（圖7c）。據報道，超聲處理會導致細胞壁塌陷，其原理是在超聲波作用下，空化產生大量小氣泡，氣泡破裂擴大孔徑并形成微觀通道，從而在更大程度上損害細胞[16]，使活性成分得到更多地釋放。

3 結論

在單因素試驗基礎上，運用響應面優化超聲波輔助提取棗渣中總三萜的試驗參數并建立其提取工藝二次多項式理論模型，模型擬合度良好。得到最佳提取條件：超聲溫度60℃，超聲時間42 min，液固比34∶1（mL/g），乙醇濃度 64%，此條件下得到的總三萜含量最高，為15.854 mg/g，與模型預測結果接近，說明此優化工藝參數可靠。與振蕩提取法對比，超聲輔助處理的樣品總三萜含量較高，通過掃描電鏡分析，UAE處理的細胞壁被嚴重破壞，而CVE處理的細胞表面相對較為平滑。對兩種提取物進行抗氧化評價，得出超聲輔助提取物清除DPPH、ABTS+和羥基自由基的IC50值分別為 0.702、0.203、0.596 mg/mL，CVE 提取物的 IC50值分別為1.000、0.665、1.043 mg/mL。當提取物濃度為1 mg/mL時，兩者對A549癌細胞的抑制率分別為37.62%和27.18%，UAE提取物的抗氧化能力和抗增殖能力明顯高于CVE提取物。棗渣中總三萜含量較為豐富，這些低成本的可再生資源若能得到較好的開發，并應用于醫療和食品行業，提高其利用價值的同時將對經濟和環境產生積極的影響。