新疆99個品種紅棗有機酸測定及其多元統計分析

梁力平，趙巖，于鑫淼，宋麗軍*

（1.商丘市質量技術監督檢驗測試中心，河南 商丘 476000；2.蚌埠學院食品與生物工程學院，安徽 蚌埠 233030）

紅棗（Ziziphus jujuba Mill.） 是鼠李科（Rhamnaceae）植物棗樹的果實[1-3]。紅棗富含單糖、有機酸、氨基酸、多酚、黃酮、三萜烯酸等多種營養素，具有抗氧化、神經保護、抗癌、抗炎癥、免疫調節及胃腸道保護等生理功效[4-6]。

我國現有棗樹品種700多個，主要分布在新疆南部、河北、陜西、山東、河南、山西、甘肅等地[7-9]。新疆具有適宜紅棗生長的地理和自然條件，棗樹栽培歷史可追溯到2 000多年前。目前，新疆紅棗種植面積超過66.67萬公頃，占全國種植總面積的30%以上，產量超過400萬噸，占全國總產量的50%以上[9-10]。新疆紅棗主要分布在環塔里木盆地區域的巴州、喀什、阿克蘇、和田以及吐哈盆地等，主要栽培品種為灰棗、駿棗、哈密大棗、贊皇棗、壺瓶棗、梨棗和冬棗等[10-12]。研究表明，紅棗的品種、栽培地理環境、氣候、土壤、貯藏條件等多種因素均對紅棗品質有影響，不同品種的紅棗具有不同的成分組成和功能性[13-15]。但由于不同品種紅棗的化學成分不同，在棗樹品種的選育、栽培以及紅棗相關產品的質量評價和標準化等方面存在一定的困難。因此，在不存在產地、栽培管理和氣候條件等差異的條件下，研究不同紅棗品種的化學特性具有重要意義。

本研究從新疆阿拉爾塔里木大學種質資源基地采集了99個紅棗栽培品種，對其有機酸的種類和含量進行系統測定；進一步采用相關性分析、層次聚類分析（hierarchical cluster analysis，HCA）和主成分分析（principal component analysis，PCA）法對99個品種紅棗進行了多變量統計分析。研究結果為在不存在區域差異的情況下，更好地了解不同棗樹品種的化學成分提供了依據，為棗樹品種的選育、栽培以及紅棗相關產品的質量評價和標準化提供基礎數據。

1 材料和方法

1.1 材料與試劑

紅棗：采集于新疆阿拉爾市塔里木大學種質資源基地，采樣時間為2018年10月20日—11月20日，各個品種樣品均處于紅熟期。從樹的四周隨機采集無病害、無機械傷的紅棗果實。樣品清洗干凈后，自然晾曬至含水量35%左右并進行冷凍干燥。凍干的樣品經過研磨，篩分（40目），真空密封包裝并于-18℃條件下儲藏備用，紅棗樣品名稱及編號見表1。

表1 紅棗樣品名稱及編號Table 1 The varieties and numbers of jujube

有機酸標準品（草酸、酒石酸、奎寧酸、蘋果酸、馬來酸、檸檬酸、富馬酸）：Dr.Ehrenstorfer公司；甲醇、乙腈（均為色譜純）：德國Merck公司；磷酸二氫銨、鹽酸（均為分析純）：北京索萊寶科技有限公司。

1.2 儀器與設備

U3000高效液相色譜儀（配有二極管陣列檢測器）、Pacific RO純水儀：美國賽默飛世爾公司；FD-1A-50冷凍干燥機：北京博醫康實驗儀器有限公司；H1650-W臺式高速離心機：湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司；R-3旋轉蒸發儀：德國IKA公司；ML204電子天平：梅特勒-托利多科技（中國）有限公司。

1.3 方法

1.3.1 有機酸標準品混合標準品制備

精確稱取標準品（草酸、酒石酸、奎寧酸、蘋果酸、馬來酸、檸檬酸、富馬酸），加入超純水分別制成10 mg/mL的標準儲備液。準確吸取上述儲備液，配制成混合標準品，經0.45 μm水系濾膜過濾后進樣。

1.3.2 方法學評價

參照文獻[16-17]的方法，采用線性范圍、檢出限、定量限等指標對高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）檢測方法進行評價。

1.3.3 有機酸的提取

精確稱取2.00 g冷凍干燥的棗粉與80 mL去離子水混合均勻，在45℃條件下，超聲波輔助提取45 min，分離上清液，提取步驟重復3次，合并上清液減壓蒸干，用超純水定容至15 mL，過0.45 μm膜，收集濾液。

1.3.4 有機酸的測定

采用高效液相色譜法測定有機酸組成，檢測器為二極管陣列檢測器，色譜柱為Agilent AQ柱（250 mm×4.6 mm，5μm），檢測波長210 nm，流動相為磷酸二氫銨溶液（10 mmol/L，pH2.55），流速 0.5 mL/min柱溫 30℃，進樣量10μL。采用外標法定量，濃度表示為mg/100g。

1.4 數據分析

所有數據均平行測定3次，試驗數據用平均值±標準差表示，p＜0.05表示差異顯著，p＜0.01表示差異極顯著。采用Origin 2019軟件進行Pearson相關分析，PCA和HCA分析采用Matlab 2018軟件進行。

2 結果與分析

2.1 標準曲線的建立和方法學評價

采用HPLC法得到的7種有機酸混合標準品色譜圖如圖1所示。

圖1 有機酸混合標準品的高效液相色譜圖Fig.1 HPLC profile of mixed standard of organic acids

由圖1可知，在試驗條件下，7種有機酸在20 min內得到了較好的分離。對7個混標梯度進行檢測，將峰面積（y）與濃度（x）進行線性擬合并建立標準曲線，并對所建立的方法進行評價，方法學評價參數結果如表2所示。

表2 方法學評價參數結果Table 2 The results of methodological evaluation parameters

由表2可知，標準曲線相關系數R2為0.999 9～1.000 0，線性良好；檢出限 0.055 μg/mL～1.010 μg/mL，定量限 0.194 μg/mL～3.350 μg/mL，加標回收率 98.21%～101.19%，相對標準偏差（relative standard deviation，RSD）均小于5%，說明該方法精密度和準確度良好，可以用于紅棗樣品中有機酸的檢測。

2.2 不同品種紅棗中有機酸的含量

對99個品種紅棗中有機酸種類和含量進行檢測，結果如圖2所示。

圖2 不同品種紅棗中有機酸種類及含量Fig.2 The varieties and contents of organic acids in different samples

由圖2可知，不同品種紅棗的有機酸種類和含量

差異較大，99個品種有機酸的總含量為19.48 mg/100 g（96號，金絲新4號）～128.92mg/100g（10號，舊莊窩棗），平均值為55.23mg/100g。所有樣品中均檢測出了蘋果酸和奎寧酸，蘋果酸含量為1.64 mg/100 g（49號，骨頭棗）～73.44 mg/100 g（10號，舊莊窩棗），奎寧酸含量為0.20 mg/100 g（87號，新鄭紅1號）～75.88 mg/100 g（60號，金絲1號）。

草酸含量最高的是短果長紅棗（99號），含量為3.72 mg/100 g；酒石酸含量最高的是上海百浦棗（53號），含量為40.44 mg/100 g；奎寧酸含量最高的是金絲小棗一號（60號），含量為75.88 mg/100 g；蘋果酸含量最高的是舊莊窩棗（10號），含量為73.44 mg/100 g；馬來酸含量最高的是露脆棗（48號），含量為1.96 mg/100 g；檸檬酸含量最高的是魯棗5號（27號），含量為16.72 mg/100 g；富馬酸含量最高的是長紫脆棗（61號），含量為 29.24 mg/100 g。

暢曉潔[3]研究得到陜西狗頭棗中有機酸含量為143.5 mg/100 g，以檸檬酸、蘋果酸含量較高；魏婷等[18]研究得到陜西冬棗有機酸含量為48.53 mg/100 g，以檸檬酸、酒石酸和草酸含量較高；劉啟玲等[19]研究得到山西板棗中有機酸含量為126.1 mg/100 g，以檸檬酸、草酸和富馬酸含量較高；李棟等[6]研究得到山西8種代表性紅棗品種有機酸含量范圍為61.5 mg/100 g（稷山板棗）～99.6 mg/100 g（臨猗梨棗），以檸檬酸、草酸和富馬酸含量較高；王慶衛等[20]研究得到河北阜平大棗有機酸含量192.7 mg/100 g，以檸檬酸和蘋果酸含量較高。由此可見，不同品種、不同產地紅棗中有機酸的種類、含量存在較大差異，這是不同品種紅棗風味差異的重要因素之一，其原因可能歸結于品種、產地土壤條件、氣候以及栽培方式的差異。總體上紅棗中有機酸含量較低，僅為常見水果（桃、杏、蘋果等）的2.5%～10%[21]。

2.3 相關性分析

采用Pearson相關性分析法研究了不同有機酸之間的關系，結果如表3所示。

表3 不同品種紅棗有機酸相關性分析Table 3 Correlation analysis of organic acids in different jujube samples

由表3可知，紅棗中有機酸總含量與酒石酸、奎寧酸、蘋果酸含量呈極顯著正相關（p＜0.01），與富馬酸呈顯著正相關（p＜0.05），表明新疆紅棗中有機酸主要由酒石酸、奎寧酸和蘋果酸3種組成，這與暢曉潔[3]和王慶衛等[20]的研究結果一致，與魏婷等[18]、劉啟玲等[19]和李棟等[6]的研究結果略有差異，其原因可能是不同紅棗產地土壤、地域及氣候等條件的差異。此外，檸檬酸含量與草酸含量相關性極顯著（p＜0.01），奎寧酸與檸檬酸、草酸相關性顯著（p＜0.05）。其他有機酸之間相關性不顯著（p＞0.05）。

2.4 聚類分析

采用HCA方法將紅棗按照有機酸種類和含量相似程度逐漸聚合在一起，相似度最大的優先聚合，最終按照類別的綜合性質實現多個品種聚合[22]。圖3為99個品種紅棗的聚類樹狀圖，表4為不同聚類中各種有機酸含量的平均值。

圖3 99個紅棗品種HCA分析圖Fig.3 Hierarchical cluster analysis dendrogram of 99 jujube varieties

表4 不同聚類中有機酸的平均含量Table 4 The mean values of the detected compounds in different clusters mg/100 g

由圖3和表4可知，基于有機酸含量，99個品種紅棗被分為5個聚類。聚類1包括38個品種，這些樣品中奎寧酸和蘋果酸這兩種最主要的有機酸含量較低，其平均值分別為12.864 mg/100 g和13.232 mg/100 g，因此其有機酸總含量也是最少的，平均值為41.564 mg/100 g。聚類2包括14個品種，其中的酒石酸含量較高，平均含量為23.084mg/100g。聚類3包括4個品種，與聚類1相反，聚類3中樣品的奎寧酸和蘋果酸平均含量最高，分別為57.94 mg/100 g和27.632 mg/100 g；因此其有機酸總含量最高，平均值為90.96 mg/100 g。聚類4包括25個品種，其中樣品的檸檬酸和草酸含量較高，平均值分別為9.348 mg/100 g和1.508 mg/100 g。聚類5包含18個品種，其樣品中馬來酸和富馬酸含量較高，平均值分別為1.128mg/100g和13.148mg/100g。

2.5 主成分分析

PCA分析可以實現數據的降維，同時保持數據集對方差貢獻最大的特征，從而直觀反映研究對象，并對其作出客觀的評價[23]。本文采用PCA分析研究了不同紅棗品種有機酸含量的差異性。表5為各主成分方差貢獻率，表6為各主成分因子向量載荷系數。

表5 各主成分方差貢獻率Table 5 Percentage of variance of each principal component

表6 各主成分因子向量載荷系數Table 6 Component matrix of principal component analysis of grading indices

由表5可知，前4個主成分的累計方差貢獻率為72.57%。由表6可知，PC1主要與蘋果酸和總有機酸含量相關，PC2主要與檸檬酸和草酸含量相關，PC3主要與酒石酸、奎寧酸和富馬酸含量相關，PC4主要與馬來酸含量相關。

圖4為99個紅棗品種的PCA分析圖。

圖4 99個紅棗品種的PCA分析圖Fig.4 PCA plot of 99 jujube varieties

圖4A中的數字代表紅棗樣品編號，圖4B中不同顏色的橢圓代表不同聚類的95%置信橢圓，若兩個橢圓之間沒有交集，說明兩個聚類組間差異顯著，反之則說明兩個聚類組間差異不顯著[1]。由圖4B可知，聚類3與聚類4，聚類3與聚類5之間沒有交集，說明其組間差異顯著，這與HCA分析結果一致：聚類3中的樣品主要有機酸（如奎寧酸和蘋果酸）和總有機酸平均含量最高（表4）。其他種群之間都存在交集，因此無法通過PCA分析完全區分它們。換言之，由于所有樣本均來自同一產地，且栽培條件相似，樣本之間有機酸含量的差異不足以對所有樣品類群進行區分，但可以在聚類水平上實現部分樣品的分類。

3 結論

本文采用HPLC法對新疆99個品種紅棗中的7種主要有機酸進行了定性定量分析，并進一步對不同品種紅棗有機酸種類和含量的差異進行了多元統計分析。紅棗中共檢測到蘋果酸、奎寧酸、酒石酸、富馬酸、檸檬酸、草酸和馬來酸7種有機酸，總含量范圍為19.48 mg/100 g～128.92 mg/100 g，其中蘋果酸、奎寧酸和酒石酸是各個品種紅棗中的主要有機酸。根據有機酸種類和含量，采用HCA將99個品種紅棗分為5個聚類；PCA共提取出4個主成分，累計方差貢獻率為72.57%。通過PCA結合HCA，聚類3和聚類4，聚類3和聚類5有機酸含量的組間差異顯著。本研究為棗樹的栽培育種、品質評價和產品開發提供重要數據支持。此外，后期利用基因組學和酶學等分子生物學技術，研究造成不同品種紅棗品質差異的分子機制是十分必要的。