磷脂酶D水解活性測定方法的研究

王鋆坦，郭碧珊，張夢雪，朱海華*，許君，劉紅偉，王法云，王慧

（1.河南省商業科學研究所有限責任公司，河南 鄭州 450002；2.河南省食品質量安全控制工程技術研究中心，河南 鄭州 450002；3.河南農業大學生命科學學院，河南 鄭州 450002；4.上海交通大學公共衛生學院，上海 200025）

磷脂酰絲氨酸（phosphatidylserine，PS）是大腦中調控細胞膜關鍵蛋白功能狀態的磷脂[1]，具有提高腦細胞活力、改善記憶力、修復大腦損傷、緩解疲勞以及平衡情緒等多種生理功能[2-3]，被稱為“腦專一性營養物質”，已通過美國食品藥品監督管理局的安全認證，被國家衛生健康委員會批準為新資源食品[4]。磷脂酶D（phospholipase D，PLD）是生物法制備PS的關鍵合成酶，具備水解磷酸二酯鍵和堿基互換的能力，可催化高純度磷脂酰膽堿（phosphatidylcholine，PC）和L-絲氨酸合成PS[5]。PLD在自然界中來源廣泛，如植物中的大豆和卷心菜、動物的腦和肝臟、微生物中的鏈霉菌和酵母等[6-7]。與動植物來源相比，微生物來源的PLD具有較強的底物耐受性，較寬廣的底物專一性和較高的堿基交換催化活性[8]，從而備受人們關注。此外，PLD在生物膜形成、脂質代謝、細胞調節和信號轉導等方面也發揮著重要作用[9-10]。

目前，對PLD的報道多集中在結構及作用機理方面，動力學方面的研究進展緩慢，其中一個限制性因素就是PLD的活力測定困難[11]，由于該酶水解反應需在水-有機相系統中進行，且反應產物為磷脂酸（弱酸）[12]，為酶活力的快速、準確測定帶來不便。傳統測定方法如分光光度法和固體顯色法是以卵磷脂的相似物為底物間接反映其活力[13]，存在靈敏度和準確度不高等問題。此外，還有放射性同位素標記、熒光標記法和高效液相法等，此類方法雖然準確，但操作復雜，不適合酶活力快速檢測[14-15]。酶聯比色法通過直接測定水解產物來檢測酶活，是目前最常用的PLD活力測定方法[16]。該方法靈敏性強、準確性高，但操作復雜，費時且成本大。同時，由于相關研究中的PLD來源不同，酶活定義和計算方法模糊，反應體系和反應條件不同，現仍存在誤差偏大、缺乏系統性等諸多問題[17]。而市面上PLD活性檢測試劑盒價格普遍較高，對樣品的適應性不強，難以滿足試驗需求[18]。因此，研究開發一種便捷、高效的磷脂酶D水解活性測定方法勢在必行。

本研究從反應機理出發，基于酶聯比色法對反應底物、反應條件、反應體系、反應終止等方面進行逐步探究和優化，旨在確定一套科學嚴謹、靈活實用、適用性強的磷脂酶D水解活性測定方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

PLD：從鏈霉菌中分離純化所得[19]；不同來源（蛋黃、大豆、鏈霉菌）以及不同純度（PC含量分別為70%、80%、90%）的卵磷脂：生工生物工程（上海）股份有限公司；膽堿氧化酶（10 U/mg）：上海碧云天生物技術有限公司；過氧化氫酶（300 U/mg）：上海源葉生物科技有限公司；FeCl3、FeSO4、CuCl2、ZnCl2、NaCl、KCl、MnCl2、MgCl2、CaCl2、TritonX-100、甲醇、乙醇、乙酸乙酯、氯仿、石油醚、二甲基亞砜、乙醚、乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA）、4-氨基氨替吡啉、苯酚（均為分析純）：國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

超凈工作臺（SW-CJ-2FD）：蘇州安泰空氣技術有限公司；立式壓力蒸汽滅菌鍋（LDZX-50KBS）：上海申安醫療器械廠；振蕩培養箱（ZQZY-78CN）：上海知楚儀器有限責任公司；臺式離心機（CT15RE）：日本日立公司；多功能微孔板檢測儀（Infine200pro）：瑞士迪肯公司。

1.3 方法

1.3.1 反應溶液制備

底物溶液：用80%乙醇溶液溶解蛋黃卵磷脂至終濃度為10 mg/mL，渦旋振蕩5 min后置于冰上待用；膽堿氧化酶母液：用蒸餾水溶解膽堿氧化酶至終濃度為250 U/mL，存放于-20℃待用；過氧化氫酶母液：用0.05 mol/L磷酸鉀緩沖液溶解過氧化氫酶至終濃度為200 U/mL存放于4℃待用。

1.3.2 酶聯比色法測定磷脂酶D水解活性

1.3.2.1 反應原理

反應分為3個階段：底物磷脂酰膽堿經PLD水解生成磷脂酸和膽堿；膽堿在膽堿氧化酶的作用下生成甜菜堿和H2O2；H2O2酶將H2O2分解為氧化物，氧化4-氨基氨替吡啉和苯酚生成粉紅色醌類混合物，于500 nm波長處下測定吸光值[20-21]。

1.3.2.2 反應體系

磷脂酶D酶活檢測包括解離和顯色兩個反應體系。解離反應體系：200 μL反應液A中加入200 μL底物溶液，37℃、200 r/min搖床預混合5min。加入100 μL稀釋后的酶液繼續反應10 min。反應結束后向解離體系中加200 μL反應終止液，37℃、200 r/min的振蕩培養箱中反應5 min，12 000 r/min離心取上清液。顯色反應體系：取2.5mL反應液B加入離心后上清并混勻，加入2 U膽堿氧化酶，2 U過氧化氫酶，放入搖床37℃、200 r/min反應30 min，制備為待測樣品溶液。

酶活測定反應體系的組成如表1所示。

表1 酶活測定反應體系的組成Table 1 Composition of reaction system for determination of enzyme activity

1.3.2.3 吸光度的檢測

使用全波長酶標儀進行吸光度檢測。取100 μL待測樣品溶液加入96孔板在500 nm波長處檢測吸光度值，分別以空板和去離子水為對照，對照組和試驗組的每個樣品做3組平行，計算均值和方差。

1.3.2.4 磷脂酶D水解活性的計算

磷脂酶D水解活性定義：在溫度為37℃和pH值為5.5的條件下，磷脂酶D每分鐘解離磷脂酰膽堿生成1 μmol膽堿所需的酶量為一個酶活力單位。

酶活力計算如下式所示。

式中：D為發酵液稀釋倍數；n為膽堿物質的量，mol；t為PLD水解時間，10 min；V為所取發酵液體積，0.1 mL。

1.3.3 底物來源的選擇及底物溶液制備

1.3.3.1 底物來源及純度的選擇

選擇不同來源（大豆、蛋黃、鏈霉菌）以及不同純度（PC含量分別為70%、80%、90%）的卵磷脂配制底物溶液進行酶活力測定。定義最高酶活力為100%，以相對酶活作圖。

1.3.3.2 底物溶劑及濃度的選擇

選擇甲醇、乙醇、乙酸乙酯、氯仿、石油醚、二甲基亞砜、乙醚等有機溶劑配制10 mg/mL的底物溶液，渦旋振蕩15 min，觀察底物溶解難易情況及反應顏色變化。對其中效果較好的乙醇溶液進一步優化，分別以30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%的乙醇溶液作溶劑進行酶活力測定。定義最高酶活力為100%，以相對酶活作圖。

1.3.4 磷脂酶D酶學性質測定

最佳反應溫度：分別設置溫度為30、37、44、51、58、65、72℃進行酶活力測定。定義最高酶活力為100%，以相對酶活作圖。

最佳反應pH值：分別設置pH值為4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0進行酶活力測定。定義最高酶活力為100%，以相對酶活作圖。

最佳金屬離子助劑：對不添加金屬離子的對照組和分別添加終濃度為10 mmol/L的金屬離子（Fe3+、Fe2+、Cu2+、Zn2+、Na+、K+、Mn2+、Mg2+、Ca2+） 試驗組進行酶活力測定[22]。定義對照組酶活力為100%，以相對酶活作圖。

1.4 統計分析

試驗重復3次，取平均值，采用SAS軟件進行顯著性分析。

2 結果與分析

2.1 磷脂酶D水解活性標準曲線

底物磷脂酰膽堿經PLD水解生成了磷脂酸和膽堿，膽堿作為反應物進行下一階段的酶聯反應，它極易吸收二氧化碳和水且遇熱分解，在酸性的反應體系中會生成更穩定的氯化膽堿[23]。為了對酶水解反應中生成的膽堿進行定量，測定了以氯化膽堿物質的量為橫坐標，500 nm下的吸光度為縱坐標的標準曲線，結果見圖1。

圖1 磷脂酶D水解活性標準曲線Fig.1 Standard curve of activity of phospholipolysis D

由圖1可知，氯化膽堿物質的量在0～2.0 μmol范圍內，與吸光度有良好的線性關系，回歸方程為y=0.461 8x+0.042 8，R2=0.998 8。根據回歸方程計算n[23]。

2.2 底物來源及純度的選擇

底物卵磷脂對相對酶活的影響結果見圖2。

圖2 不同來源及純度的卵磷脂與相對酶活的關系Fig.2 Relationship between lecithin from different sources and purity and relative enzyme activity

由圖2可知，鏈霉菌來源的卵磷脂的相對酶活檢測水平最高，70%純度的底物相對酶活可保持在78%。大豆來源的卵磷脂的相對酶活最低，90%純度的底物的相對酶活僅有62%。蛋黃卵磷脂的相對酶活隨純度的升高逐漸增強，90%純度的蛋黃卵磷脂作為底物的相對酶活能保持在75%。鑒于鏈霉菌來源的卵磷脂價格昂貴，大豆來源的卵磷脂相對酶活檢測穩定性差，90%純度的蛋黃卵磷脂成本低廉，相對酶活檢測穩定性高。綜合考慮選擇90%純度的蛋黃卵磷脂作為底物。

2.3 底物溶劑及濃度的選擇

2.3.1 底物溶劑的選擇

卵磷脂是一種混合物，除含有參與反應的磷脂酰膽堿外，還包含磷脂酰乙醇胺、磷脂酰肌醇和膽堿等物質[24]。有機磷脂有其特定的溶解條件，根據相似相溶原理，需用極性有機試劑溶解。不同溶劑對底物卵磷脂的溶解情況見表2。

表2 不同溶劑溶解卵磷脂的情況及反應顏色變化Table 2 The situation of dissolving lecithin in different solvents and the change of reaction color

由表2可知，選擇不同試劑溶解底物，發現簡單醇類對卵磷脂溶解度較好，甲醇、乙醇、乙醇水溶液這3種溶劑對底物溶解情況最佳，顏色變化也相對更明顯?？紤]到酶聯反應的特殊性，溶劑在保證能完全溶解底物的同時須兼顧后續反應，對體系中其它反應物也要有較好的溶解度。由于反應在水相中進行，而卵磷脂、膽堿、苯醌都能溶于乙醇，因此選擇乙醇水溶液作為底物溶劑。

2.3.2 乙醇含量的選擇

乙醇含量對相對酶活的影響結果見圖3。

圖3 乙醇含量與相對酶活的關系Fig.3 Relationship between ethanol content and relative enzyme activity

由圖3可知，當乙醇含量為30%時，相對酶活僅有42%。隨著乙醇占比增高，PLD的相對酶活也逐漸增高，在乙醇含量為80%時，PLD相對酶活達到最高；乙醇含量達到90%時，相對酶活明顯下降，保持在85%。乙醇含量在90%～100%之間相對酶活差異不明顯，無水乙醇作底物溶劑時相對酶活為78%。

2.4 磷脂酶D的酶學性質

2.4.1 最佳反應溫度

溫度對相對酶活的影響結果見圖4。

圖4 溫度與相對酶活的關系Fig.4 Relationship between temperature and relative enzyme activity

由圖4可知，在37℃時，測得的PLD酶活力水平最高，以其為對照，計算其它溫度下的相對酶活。隨著溫度的升高，相對酶活逐漸升高，當溫度升高到44℃時，PLD相對酶活明顯下降，在44℃～51℃之間相對酶活差異不明顯，72℃時相對酶活達到最小值。

2.4.2 最佳反應pH值

pH值對相對酶活的影響結果見圖5。由于PLD酶解離磷脂酰膽堿生成膽堿的反應在酸性環境下進行，因此設置pH值均小于7。

圖5 pH值與相對酶活的關系Fig.5 Relationship between pH and relative enzyme activity

由圖5可知，pH值為4.0時相對酶活僅為60%，隨著pH值的升高，PLD的相對酶活逐漸增高，在pH值為5.5時達到最高值，pH值為6.0時PLD相對酶活保持在85%，pH值在6.0～6.5之間相對酶活差異不明顯，在pH值為7.0時仍能保持72%的相對酶活。

2.4.3 不同金屬離子對相對酶活的影響

不同金屬離子對相對酶活的影響結果見圖6。

圖6 不同金屬離子與相對酶活的關系Fig.6 Relationship between different metal ions and relative enzyme activity

由圖6可知，加入 Cu2+、Zn2+、Mn2+時，PLD 的相對酶活明顯下降，其中Mn2+最低，相對酶活為71%。加入Fe3+、Fe2+、Na+、K+、Mg2+、Ca2+時，PLD 的相對酶活升高，分別為120%、118%、130%、132%、140%和150%，加入Ca2+后相對酶活的提升最為明顯，較對照組提高了50%。

3 結論

本文通過對酶聯比色法測定磷脂酶D水解活性的方法進行研究，分別對反應底物、反應體系、反應條件和反應過程進行了一定的改良和優化。選擇蛋黃卵磷脂和80%的乙醇溶液配制底物溶劑，同時配制反應液A、B，簡化試驗步驟，試驗測得水解反應的最佳條件為37℃，pH值為5.5，同時加入10 mmol/L CaCl2作為金屬離子助劑。反應終止液成分：0.1 mol/L pH值為8.0的 Tris-HCl、10 mmol/L EDTA 和 10 g/L 16-烷基-3-甲基氯化銨。該方法測定磷脂酶D的酶活力在保證靈敏度的情況下兼具可操作性，減少了對儀器設備和樣品種類的限制，降低了成本，有較強的應用價值。