傘枝犁頭霉純菌與強化發酵普洱茶研究

劉琨毅，王利妍，安江珊，王興華，5，羅慧，陳立佼，馬燕*，趙明，2*

（1.云南農業大學茶學院，食品科學技術學院，云南 昆明 650201；2.云南農業大學云南省藥用植物生物學重點實驗室，西南中藥材種質創新與利用國家地方聯合工程研究中心，云南 昆明 650201；3.宜賓職業技術學院五糧液技術與食品工程學院，四川 宜賓 644003；4.安徽農業大學資源與環境學院，安徽 合肥 230036；5.普洱市茶葉科學研究所，云南 普洱 665000）

傳統發酵食品（fermented foods）是一類依靠微生物的作用將原料中的營養物質進行分解與轉化，產生相應代謝產物的一類食品。該類食品有制作成本低、風味獨特及具有較高的營養價值等優點，在世界范圍分布廣泛[1-2]。發酵工藝已有上千年的歷史，有保藏食品、豐富食品種類和有益于身體健康的作用[3]。但在傳統發酵食品發酵過程中往往存在微生物來源復雜、不可控等問題，從而導致其質量不穩定[4-5]。因此，亟需對傳統發酵食品發酵工藝進行改進。強化發酵是將一種或多種外源微生物接入到未經滅菌的原料中進行發酵，以期提高發酵產品質量的方法[6]。例如，乳酸菌和酵母菌強化發酵四川泡菜可以明顯提高總酸、總酯含量，從而改善產品風味[7]；接種黑曲霉發酵普洱茶可改善其感官品質[8]。因而，強化發酵可作為一種改進發酵食品工藝的方法。

普洱茶是我國特有的名茶[9]，具有抗高脂血癥、抗氧化、抗腫瘤和預防糖尿病等多種保健功能[10-11]。其發酵過程主要依靠適宜在茶葉原料中生長繁殖的微生物[12-13]，在發酵過程中微生物會產生多種酶類，這些酶類對普洱茶的品質有一定的影響[14]。由于普洱茶生產過程處于開放的環境中，其會存在產品質量不穩定的現象[15]。國內已有關于接菌強化發酵普洱茶的研究，研究表明，強化發酵可縮短加工時間、降低成本、提高茶葉感官品質[16-17]。綜上，強化發酵是提高普洱茶品質的有效途徑之一，但適宜普洱茶強化發酵的微生物還需要進一步研究。

傘枝犁頭霉（Absidia corymbifera）是一種能產淀粉酶和酯化酶的真菌，在傳統發酵食品，如食醋[18]、白酒[19]、普洱茶[20]的生產過程中均有一定應用。其在發酵過程中能產生α-酮戊二酸，由此參與糖類、蛋白質的代謝[21]。作為一種在普洱茶發酵中存在的微生物，傘枝犁頭霉進行的普洱茶強化發酵是否能夠影響發酵過程中的微生物群落，進而改善普洱茶的品質特征，需要進一步研究。本文將從普洱茶中分離鑒定得到的傘枝犁頭霉A1接種于滅菌或未滅菌的曬青茶中，對普洱茶進行純菌發酵和強化發酵，分析發酵樣品的感官特征、化學成分及微生物群落結構，以期評估該菌用于普洱茶強化接菌發酵的可行性，為提高普洱茶品質提供試驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

曬青茶（一芽三葉）原料（raw material，RM）：云南省普洱市茶葉科學研究所；兒茶素[（+）-catechin，C]、沒食子酸（gallic acid，GA）、表兒茶素[（-）-epicatechin，EC]、表沒食子兒茶素[（-）-epigallocatechin，EGC]、表兒茶素沒食子酸酯[（-）-epicatechin-3-gallate，ECG]、表沒食子兒茶素沒食子酸酯[（-）-epigallocatechin-3-gallate，EGCG]、沒食子兒茶素[（-）-gallocatechin，GC]、兒茶素沒食子酸酯[（-）-catechin gallate，CG]、沒食子兒茶素沒食子酸酯[（-）-gallocatechin gallate，GCG]、鞣花酸（ellagic acid，EA）、咖啡堿（caffeine，CA）、楊梅素（myricetin，MY）、槲皮素（quercetin，QU）、木犀草素（luteolin，LU）、山奈酚（kaempferol，KA）標準品：成都曼思特生物科技有限公司；真菌DNA提取試劑盒、細菌DNA提取試劑盒：上海生物工程有限公司；馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potato dextrose agar，PDA）培養基：青島海博生物技術有限公司；DNA聚合酶（2×Rapid Taq Master Mix）：南京諾唯贊生物科技公司；DNA Ladder Marker（DNA 分子量標準試劑）、5×Loading Buffer for Agarose gels（DNA染料）：上海捷瑞生物工程公司；硫酸亞鐵、酒石酸鉀鈉（均為分析純）：天津市風船化學試劑有限公司；茚三酮、氫氧化鈉（均為分析純）：天津市科密歐化學試劑有限公司；DNA引物：北京擎科生物科技有限公司昆明分公司。

1.2 儀器與設備

HH-S28S型數顯恒溫水浴鍋：金壇市大地自動化儀器廠；756CRT型紫外可見分光光度計：上海菁華科技儀器有限公司；CP214型電子分析天平：上海奧豪斯儀器有限公司；CT15RE型離心機：日本日立公司；SW-CJ-1B型超級工作臺：蘇州安泰空氣技術有限公司；LRHS-250-Ⅱ型生化培養箱：上海躍進醫療器械有限公司；1200型高速液相色譜：配有TSKgel ODS-80TM色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），美國安捷倫公司；Trident 960型基因擴增儀：上海力新儀器有限公司；DW-86L626型醫用低溫保存箱：青島海爾生物醫療股份有限公司；YS6060型色差儀：深圳市三恩時科技有限公司；XB.K.25型血球計數板：上海求精生化試劑儀器有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 傘枝犁頭霉A1的分離鑒定

對從普洱茶中分離純化得到的菌株A1進行形態學觀察及真菌內轉錄間隔區（internal transcribed spacer，ITS）序列進行DNA測序分析[22]，并利用ITS的DNA序列進行系統發育分析，明確菌株A1的系統分類學地位。

1.3.2 傘枝犁頭霉A1菌懸液的制備

將傘枝犁頭霉A1，接種于PDA培養基中，25℃培養7 d。用無菌生理鹽水沖洗收集其孢子并計數后，將1%的1×107的孢子接種到茶葉培養基中，25℃振蕩培養4 d，轉速120 r/min。其中，茶葉培養基是用蒸餾水（2 L）在 100℃條件下提取曬青茶（100 g）30 min，四層紗布過濾，然后121℃滅菌20 min制成。

1.3.3 傘枝犁頭霉A1純菌發酵（pure fermentation，PF）普洱茶試驗

稱取100 g曬青茶置于500 mL三角瓶中，加入40 mL蒸餾水，濕熱滅菌（121℃，20 min），冷卻后待用。分別將1 mL1×107的傘枝犁頭霉A1的孢子的菌懸液接種于滅菌茶樣中，28℃、相對濕度60%的培養箱中發酵20 d后取出，-80°C貯藏待用，樣品命名為PF；將滅菌茶樣不接菌進行相同操作為對照樣品（control check，CK）。每組樣品進行3個重復。

1.3.4 傘枝犁頭霉A1強化發酵（enhanced fermentation，EF）普洱茶試驗

強化發酵普洱茶試驗：在25 kg曬青茶中加入10 L蒸餾水，再加入250 mL傘枝犁頭霉A1的菌懸液拌和混勻后裝入發酵筐（50 cm×40 cm×60 cm），進行靜置發酵；每隔5 d將茶葉取出翻堆一次后再裝入發酵筐，25 d后發酵完成。在每次翻堆前，采用五點取樣法取樣，-80°C貯藏待用，其中每一翻樣品命名為EF1～EF5；將每一翻自然發酵（normal fermentation，NF）的樣品（未接入傘枝犁頭霉A1）命名為NF1～5。每組樣品進行3個重復。

1.3.5 茶葉化學成分測定及感官審評

參考Zhao等[12]分析茶葉特征成分的方法，分別采用恒重法、酒石酸亞鐵法、茚三酮比色法、蒽酮法測定茶葉樣品水浸出物（water extracts，WE）、茶多酚總量（tea polyphenols，TP）、游離氨基酸（free amino acids，FAA）、可溶性糖（soluble sugars，SS）的含量；應用萃取比色法[23]檢測茶紅素（thearubigins，TR）、茶黃素（theaflavins，TF）及茶褐素（theabrownins，TB）含量；采用實驗課題組建立的高效液相色譜法[13]（high performance liquid chromatography，HPLC）定量分析茶葉樣品 中 GA、CA、EA、QU、LU、KA、MY、C、EC、EGC、ECG、EGCG、GC、GCG和CG的含量。9位評茶員根據GB/T 23776—2018《茶葉感官審評方法》[24]對茶葉樣品的感官品質進行審評；其中，采用定量描述分析法[25]對茶湯滋味特征進行評價，包括苦味、澀味、酸味、甜味和厚重感5個屬性，分數從0（無）到9（非常強烈）。同時用色差儀對茶湯的顏色進行測定，其中a*為紅綠色，b*為黃藍色，L*為明暗度。

1.3.6 基于高通量測序進行微生物多樣性分析

采用真菌DNA提取試劑盒、細菌DNA提取試劑盒分別提取接種發酵普洱茶樣品的真菌和細菌DNA，應用 DNA 聚合酶（2×Rapid Taq Master Mix）進行聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）。其中，利用引物338F和806R擴增細菌16S rRNA的V3-V4區；以引物ITS5-1737F和ITS2-2043R擴增真菌ITS1的V2區。委托深圳微生態公司，應用Illumina MiSeq測序平臺對PCR產物進行基因測序[15]。通過QIIME軟件檢查并剔除嵌合體序列等疑問序列，選擇序列比對工具對獲得的序列按97%的相似度進行聚類和OTU劃分，繪制稀疏曲線，計算Alpha多樣性指數，評估每個樣本的多樣性水平[26]。

1.4 數據處理

應用IBM spss statistics 22.0軟件進行統計分析和數據處理，數據以平均值±標準差表示；采用SIMCA14.1軟件進行主成分分析；基因測序結果已上傳至美國國家生物技術信息中心（National Center for Biotechnology Information，NCBI）基因數據庫，編號為 MZ570265 和PRJNA691718。

2 結果與分析

2.1 傘枝犁頭霉A1的分離鑒定

將菌株A1接種到PDA培養基中培養3 d后，將菌株A1測序所得序列與NCBI數據庫進行比對，選擇模式物種進行建樹，傘枝犁頭霉A1的分離鑒定結果如圖1所示。

圖1 傘枝犁頭霉A1的分離鑒定Fig.1 Isolation and identification of Absidia corymbifera A1

結果表明，菌株A1菌絲呈毛狀、無匍匐菌絲，菌絲無隔膜、頂端膨大形成圓形的孢子囊（圖1A和圖1B）；A1與AY944895.1-A.corymbifera聚為一支（圖1C），故將A1命名為傘枝犁頭霉A1（A.corymbifera A1）。

2.2 傘枝犁頭霉A1純菌發酵對茶葉品質的影響

對傘枝犁頭霉A1純菌發酵普洱茶樣品與對照樣品（CK）進行感官審評，PF的茶湯呈橙紅色、滋味醇厚，CK的茶湯為黃綠色、澀味較為突出。表明傘枝犁頭霉A1純菌發酵能改變曬青茶的感官特征，并與傳統普洱茶的感官品質（茶湯呈紅褐色、滋味醇厚回甘）相似[27]。采用高效液相色譜法和分光光度法測定22種茶葉特征成分的含量，結果如圖2所示。

圖2 不同茶葉樣品中22種茶葉特征成分Fig.2 22 tea characteristic components in different tea samples

由圖2可知，與CK相比，PF中茶多酚（TP）和5種兒茶素（C、EGC、EGCG、ECG、CG）含量顯著降低（P＜0.05），因此PF茶湯苦澀度降低；而因茶褐素（TB）和茶紅素（TR）含量顯著增加（P＜0.05），使得茶湯由黃綠色變為紅褐色。這些茶葉特征成分的變化也與傳統普洱茶發酵過程中物質的變化相似[28]，故傘枝犁頭霉A1對普洱茶的發酵起到積極作用。

2.3 傘枝犁頭霉A1強化發酵對茶葉品質的影響

對自然發酵及強化發酵樣品進行感官審評，結果見表1和圖3。

表1 NF與EF感官審評結果Table 1 Sensory evaluation results of normal fermentation（NF）and enhanced fermentation（EF）

圖3 NF和EF干茶、茶湯、茶底的感官特征Fig.3 Sensory characteristics of dry tea，tea infusion and wet tea leaf in normal fermentation（NF）and enhanced fermentation（EF）

由表1和圖3可知，經NF和EF處理后，茶湯均呈紅褐色、滋味回甘、香氣純正，但EF茶湯顏色更深、滋味更加醇厚、香氣略帶怡人的陳香。經色差儀測定兩者茶湯顏色時，發現EF的a*值（27.55±0.44）和b*值（77.59±1.12）較高，而 L*值（67.53±0.98）較低。9位評茶員審評茶湯后得出，EF的甜味（4.78±0.83）和厚重感（6.89±0.93）分值較高，而苦味（3.67±0.78）、澀味（1.11±0.50）和酸味（0.22±0.44）分值較低，進一步說明了EF具有更深的紅褐色和更好的風味。

由茶葉特征成分含量可知，EF中TB和SS含量顯著高于NF（P＜0.05），與感官審評EF具有更深的紅褐色和更顯著的甜味的結果相符；而C、CG、EC、GCG、EGCG、ECG 和 EGC 含量顯著低于 NF（P＜0.05），驗證了EF的苦澀度較NF更低。因此，傘枝犁頭霉A1強化發酵提高了普洱茶的感官品質。

2.4 傘枝犁頭霉A1強化發酵對微生物群落結構的影響

NF和EF的茶葉樣品微生物群落的豐富度與α多樣性指數，如表2所示。

表2 茶葉樣品微生物群落的豐富度與α多樣性指數Table 2 Richness of microbial communities and alpha diversity indices in tea samples

由表2可知，經過QIIME軟件檢查并剔除嵌合體序列等疑問序列后，得到54 330～103 310個序列，歸類為503個～833個真菌OTUs、482個～1978個細菌OTUs。隨著發酵的進行，EF中真菌及細菌的豐富度和多樣性增加，但在發酵后期（EF4～EF5）均有所下降，與NF細菌的豐富度和多樣性在發酵后期（NF4～NF5）整體上呈繼續上升趨勢形成差異。

茶葉樣品中真菌種水平和細菌屬水平的群落結構如圖4所示。

圖4 茶葉樣品中微生物群落結構Fig.4 Microbial community structure in tea samples

由圖4可知，在發酵過程中EF和NF的微生物群落結構動態變化，且在各個階段差異顯著（圖4A和圖4B）。主要原因是發酵過程中化學成分的不斷變化以及微生物之間的相互作用（如共生和拮抗作用）[29]。如圖4C所示，在原料（RM）中優勢真菌為Brunneoclavispora bambusae（41.50%），黑曲霉（21.18%）和馬克斯克魯維酵母（17.27%）。在強化發酵樣品中，B.bambusae（31.98%）是發酵初期（EF1）的優勢真菌，隨著發酵進行，微小根毛霉（38.76%～70.60%）迅速生長繁殖，在發酵中期（EF2～EF3）成為優勢真菌，食腺嘌呤芽生葡萄孢酵母（40.13%）在發酵后期（EF5）成為優勢真菌；另外黑曲霉（6.38%～13.93%）在整個發酵階段均為優勢真菌（圖4C）。作為對比，在傳統自然發酵過程中黑曲霉始終是優勢真菌（26.64%～37.40%），此外在發酵初期（NF1）的優勢真菌還包括馬克斯克魯維酵母（31.28%），隨著發酵的進行，微小根毛霉（37.48%～61.22%）迅速繁殖，與黑曲霉共同組成發酵中后期（NF2～NF5）的優勢真菌。雖然在發酵初期將傘枝犁頭霉A1接種到未經滅菌的曬青茶中進行強化發酵，但是整個發酵過程處于開放狀態，環境中的微生物也會進入發酵系統。因此，一些適合在茶葉上生長的微生物會在這種發酵體系中生長并大量繁殖。

如圖4D所示，RM的優勢細菌主要是腸桿菌（20.94%）、金黃桿菌（16.65%）和假單胞菌（6.90%）。在強化發酵過程中，假單胞菌（16.42%～61.70%）、擬桿菌（9.66%～19.42%）和芽孢桿菌（8.54%～20.65%）是發酵中前期（EF1～EF2）的優勢細菌，隨著發酵的繼續進行，短狀桿菌（14.27%～19.90%）、考克氏菌（13.02%～24.04%）和葡萄球菌（33.97%～48.71%）共同成為發酵中后期（EF3～EF5）的優勢細菌（圖4D）。在傳統自然發酵過程中，發酵前期（NF1）的優勢細菌主要是大腸埃希-志賀菌（32.41%）、克雷白氏菌（27.41%）和假單胞菌（24.54%）；芽孢桿菌（37.07%）在發酵中期（EF3）成為優勢細菌；而在發酵后期（EF5），大腸埃希-志賀菌（16.46%）再次成為優勢細菌。

綜上，盡管在強化發酵過程中傘枝犁頭霉A1沒有成為優勢真菌，但相對于NF顯著改變了其它微生物的相對豐度，例如增加了B.bambusae、食腺嘌呤芽生葡萄孢酵母、微小根毛霉、葡萄球菌、假單胞菌和芽孢桿菌的相對豐度，降低了黑曲霉、馬克斯克魯維酵母、大腸埃希-志賀菌和克雷白氏菌的相對豐度。微生物相對豐度的這些變化解釋了強化發酵樣品的茶葉特征成分和感官特征的變化。

3 結論

將傘枝犁頭霉A1接種于滅菌或未經滅菌的曬青茶中，分別進行純菌發酵與強化發酵。經純菌發酵后茶葉中茶多酚和 5 種兒茶素（C、EGC、EGCG、ECG、CG）含量顯著降低（P＜0.05），茶褐素和茶紅素含量顯著增加（P＜0.05）。經強化發酵后茶褐素和可溶性糖含量顯著高于傳統自然發酵（P＜0.05），而 C、CG、EC、GCG、EGCG、ECG 和 EGC 含量顯著降低（P＜0.05）；茶湯的感官特征隨之發生變化，例如，a*、b*、甜味和厚重感的數值增加，L*、苦味、澀味和酸味數值降低。雖然傘枝犁頭霉A1在強化發酵過程中沒有成為優勢真菌，但其促使了其他幾種主要微生物相對豐度的顯著變化，如增加了B.bambusae、食腺嘌呤芽生葡萄孢酵母、微小根毛霉、葡萄球菌、假單胞菌和芽孢桿菌的相對豐度，降低了黑曲霉、馬克斯克魯維酵母、大腸埃希-志賀菌和克雷白氏菌的相對豐度。因此，接種傘枝犁頭霉A1進行的強化發酵通過與其它微生物的協同作用改變普洱茶中茶葉的特征成分，從而提高普洱茶的感官品質。