影響腦膠質瘤患者預后的固有免疫分子篩選與驗證

田志，賈薇，石瓊婭，毛輝，黃純海，黃軍

1.湘西土家族苗族自治州人民醫院神經外科，湖南吉首 416000；2.吉首大學醫學院生理研究室，湖南吉首 416000；3.中南大學湘雅醫院神經外科，湖南長沙 410008

膠質瘤系神經膠質細胞起源的腫瘤， 屬于最常見的原發性顱內腫瘤，美國腦腫瘤注冊中心(Central Brain Tumor Registry Of the United States,CBTRUS)統計，中樞神經系統腫瘤的27%是膠質瘤，約占惡性腫瘤的80%，也是人類十大最常見致死性腫瘤之一[1]。我國膠質瘤年發病率為（3～6.4）/10 萬,年死亡人數達3 萬[2]。 迄今，有關膠質瘤的免疫應答及調控機制尚未被完全闡明，其原因有：①中樞神經系統結構頗為復雜； ②對中樞神經系統免疫的細胞學基礎知之甚少； ③外周血循環中的免疫細胞和免疫分子遷入中樞神經系統的途徑和機制尚不清楚。 在膠質瘤的免疫機制研究中， 固有免疫因子越來越受到研究人員的重視。 因而該研究選擇固有免疫基因作為膠質瘤相關診斷和預后分子篩選的方向。

1 材料與方法

1.1 數據的獲取

所有人類固有免疫基因及其表達蛋白的數據分別從兩個開放的網站，AmiGO 2.0(http://amigo.geneontology.org/amigo/search/bioentity) 中以“homo innate immune” 為 關 鍵 詞 檢 索 和GeneCards（http://www.genecards.org/）中以“innate immune response homo sapiens”為關鍵詞檢索分別獲取。

從Oncomine(www.oncomine.org)中獲取具有代表意義的人腦膠質瘤差顯基因。納入標準：符合以下標準的數據集將納入研究對象：①P＜0.05；②差異倍數絕對值≥2 倍；③差異表達基因中上調表達的top10%。

從癌癥基因組圖譜TCGA 數據庫（https://portal.gdc.com） 獲取人腦膠質瘤樣本的RNA 測序數據的原始計數和相應的臨床信息。 考慮到TCGA 中正常樣本較少，從GTEx(Genotype-Tissue Expression)數據庫中獲取正常組織的mRNA 表達數據及miRNA 表達數據。

從基因表達綜合（Gene Expression Omnibus，GEO）數 據 庫（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）獲 取 芯 片表達譜數據和相應的臨床信息作為外部驗證數據進一步檢驗篩選結果。

1.2 方法

利用Venny 2.1 軟件工具對獲取的人類固有免疫基因及其表達蛋白與獲取的人腦膠質瘤差顯基因數據進行交互分析得出人腦膠質瘤中差異表達的固有免疫基因。 利用v4.0.3 版R 軟件 （R Foundation for Statistical Computing，2020）對TCGA 數據集中的全基因組RNA 測序數據和臨床信息進行分析，采用logrank 檢驗和單變量Cox 比例危險回歸分析方法，得出TCGA 中基因生存預后顯著基因并再次與前述獲取的人腦膠質瘤中差異表達的固有免疫基因進行交互分析得出膠質瘤中生存預后顯著的差顯固有免疫基因。

根據篩選結果中的基因， 對獲取的TCGA 數據庫中膠質瘤樣本按RNA 測序數據分為高表達組和低表達組， 其中相對表達量高于平均值定義為高表達，低于平均值定義為低表達，采用秩和檢驗檢測兩組數據， 通過KM 生存分析比較TCGA 數據庫中不同表達組之間的生存差異，同時進行timeROC 分析以比較基因的預測準確性和風險評分。 最小絕對收縮和選擇算子（LASSO）回歸算法進行特征選擇，采用10 倍交叉驗證， 對于Kaplan-Meier 曲線，P值和具有95%置信區間（CI）的危險比（HR）通過logrank檢驗和單變量Cox 比例危險回歸得出。

按照臨床病理檢查結果， 將TCGA 數據庫中的膠質瘤樣本分為膠質母細胞瘤（GBM）組和低級別膠質瘤（LGG）組，從GTEx 數據庫中獲取的正常組織作為對照組，采用秩和檢驗中的H 檢驗方法(Kruskal-Wallis)分析各組之間CD58 的差異表達；將通過KM生存分析比較TCGA 數據庫中不同表達組之間的生存差異。 以上所有分析方法和R 軟件包均使用v4.0.3 版R 軟件（R Foundation for Statistical Computing，2020）執行，P＜0.05 為差異有統計學意義。

從NCBI 數據庫獲得芯片表達譜數據， 按照臨床信息中的病理檢查結果，將獲取的數據中Ⅲ、Ⅳ級膠質瘤樣本納入高級別膠質瘤（HGG）組，將獲取的數據中Ⅰ、Ⅱ級膠質瘤樣本納入低級別膠質瘤（LGG）組，正常組織作為對照組，采用秩和檢驗中的H檢驗方法(Kruskal-Wallis)分析各組之間CD58 的差異表達，通過Kaplan-Meier 生存曲線分析顯示膠質瘤樣本中的CD58 表達水平差異與預后生存相關性，以此作為外部驗證檢驗篩選結果。

2 結果

從AmiGO 2.0 檢索所得人類固有免疫基因共計1 042 個，從GeneCards 獲取人固有免疫應答反應相關基因為2 113 個，從Oncomine 中3 個不同的獨立基因數據庫：TCGA、Murat brain 和Sun Brain， 獲取膠質瘤差顯基因中具有上調意義的前10%分別為1 262 個、1 957 個和1 957 個。

從AmiGo 和GeneCards 獲取固有免疫應答反應相關基因分別為1 042 個和2 113 個， 通過Venny 2.1 工具作出韋恩圖交互， 其中共有150 個基因重疊，兩者合并后為2 855 個，見圖1A。

通過Venny 2.1 工具作出韋恩圖交互，2 855 個固有免疫應答反應相關基因與TCGA、Murat brain、Sun brain3 個數據庫的基因數據比對分析， 發現了在這3 個不同膠質瘤基因數控庫中均有顯著差異上調表達的固有免疫基因有62 個，見表1、圖1B。

通過對TCGA 中人腦膠質瘤的全基因組數據分析， 得出了人腦膠質中基因單因素Cox 分析生存預后最顯著的前20 個基因和預后特征的P值、風險系數HR 以及置信區間，見圖2。

通過Venny 2.1 工具作出韋恩圖交互， 顯著差異上調表達的固有免疫基因與TCGA 中基因生存預后顯著基因比對分析， 發現了3 個膠質瘤中生存預后顯著的差顯固有免疫基因CD58、IGFBP2、PTX3，見圖1C、圖2。

通過篩選， 與生存預后顯著相關的差顯基因有3 個：CD58、IGFBP2、PTX3， 該研究選擇其中風險系數最高的CD58 做進一步生物信息學分析。

該研究從TCGA 數據庫中獲取了663 個患者膠質瘤的RNA 測序數據（第3 級）的原始計數和相應的臨床信息 (見表2)。 通過分析TCGA 數據庫中CD58 基因顯示膠質瘤樣本中的CD58 表達水平越高， 則患者生存時間越短， 差異有統計學意義(P＜0.001)，見圖3A、圖3B。 該研究通過分析該基因不同時間的ROC 曲線與AUC， 發現其AUC 值均高于0.7，見圖3C。

通過整合GTEx 數據庫中的正常組織的數據和TCGA 腫瘤組織的數據分析CD58 在不同級別膠質瘤和非瘤組織中的表達差異， 可見腫瘤級別越高，CD58 表達越明顯， 數據庫中GBM 的表達均顯著高于LGG 和對照組，差異有統計學意義（P＜0.001）；同時顯示膠質瘤級別越高，則患者生存時間越短，差異有統計學意義(P＜0.0001)，見圖4。

表1 膠質瘤中固有免疫應答反應相關差異表達基因

圖2 TCGA 膠質瘤中生存預后最顯著的前20 個基因森林圖

從NCBI 數據庫獲得芯片表達譜數據GSE16011，相應數據平臺為GPL570，GSE16011 含276 例膠質瘤組織樣本和8 例非瘤腦組織樣本。 通過分析CD58表達與膠質瘤級別的相關性， 結果數據庫中腫瘤級別越高，CD58 表達越明顯，數據庫中HGG 的表達均顯著高于LGG 和對照組， 差異有統計學意義 （P＜0.001），見圖5。

表2 TCGA 膠質瘤患者臨床信息

在獨立的膠質瘤數據庫(GSE16011)中，共20 例低級別膠質瘤、133 例高級別膠質瘤有完整的存活數據，通過Kaplan-Meier 生存曲線分析顯示膠質瘤樣本中的CD58 表達水平越高， 則患者生存時間越短，差異有統計學意義(P＜0.001)，見圖6A。 考慮到低級別膠質瘤樣本量少， 該研究單獨分析了HGG 中D58 表達差異與預后生存相關性， 顯示HGG 中的CD58 表達水平越高，則患者生存時間越短，差異有 統計學意義(P＜0.001)，見圖6C。 通過分析該基因不同時間的ROC 曲線與AUC， 發現其AUC 值均高于0.7，見圖6B、圖6D。

圖3 CD58 在膠質瘤中差異表達與生存預后相關情況

圖4 CD58 在不同級別膠質瘤組織中及正常組織的差異表達和生存差異情況

圖5 CD58 在GSE16011 數據集不同組織中差異表達情況

3 討論

作為一門新興的學科， 生物信息學通過分析基因組序列信息等原始數據， 再利用計算機技術對各種各生物信息進行查詢、檢索及比對后，從而獲得基因編碼表達及調控、核酸和蛋白質編碼區結構功能、各蛋白間相互關系及蛋白質空間結構模擬和預測，并對特定蛋白質的功能進行必要的研究與應用[3]。已經有眾多的研究人員利用生物信息學分析方法發現了一些基因或者信號通路與膠質瘤發生發展具有重要相關的成果，Duerr E M 等[4]發現在大約20%的惡性膠質瘤患者中有PTEN 基因的突變發生，Lin B 等[5]發現了多形性膠質母細胞瘤中TGF-β 信號通路及其相關蛋白的激活作用，Zhang J 等[6]發現了miR-221/222 共同調節靶向基因并通過Akt 信號通路從而在膠質瘤中發揮協同調控功能。 通過生物信息學分析方法人們還發現了在膠質瘤細胞增殖中可能發揮作用的一種新的嗜酸激酶[7]。同時研究人員還發現在膠質瘤中抑制miR-34a 功能能夠促進其靶向基因PDGFRA 的表達[8]。 隨著人類基因組計劃的工作完成， 從分子水平觀測腦膠質瘤的產生和發展機制成為可能， 運用各種數據分析技術對膠質瘤及其亞型進行預測和診斷， 了解致癌基因和抑癌基因之間相互關系，構建基因和蛋白調控網絡，對于加快膠質瘤的廣度和深度研究具有重要的價值。

以往認為大腦為免疫豁免器官，這是因為中樞神經系統的免疫相關組織結構十分獨特： ①缺少原位DC（dentritic cell，樹突狀細胞）和淋巴流。 ②具有血腦屏障以維持中樞神經系統內環境穩定。 但研究表明，膠質瘤的發生發展、治療和預后與患者機體中的免疫功能和免疫相關分子水平密切相關[9]，現有的臨床試驗發現膠質瘤患者通過免疫治療可以取得包括長期生存和腫瘤消退在內的臨床獲益， 從而達到延緩腫瘤復發，提高腫瘤的治療效果[10-17]。 固有免疫相關的效應分子和細胞廣泛參與免疫應答的啟動、效應和調節過程， 因此固有免疫在機體的免疫防御機制中發揮著十分重要的作用。固有免疫分子CD58又被稱為淋巴細胞功能相關抗原-3（Lymphocyte Function associated Antigen-3，LFA-3），其與CD2 的結合可促進TCR-多肽-MHC 三聯復合物的形成，從而輔助抗原遞呈， 還可以在一定程度上提高TCR/CD3 分子的接觸密度， 并在缺乏持續性抗原刺激時能維持機體的免疫功能狀態， 同時參與了機體多種細胞因子的產生和免疫細胞的聚集[18]。CD58 與CD2結合為T 細胞激活的旁路系統， 可增殖與活化淋巴細胞，并促進T 細胞分泌IL-2 和B 細胞分泌免疫球蛋白， 這種旁路激活途徑不需要巨噬細胞等輔助細胞的參與，具抗原非特異性。最近的研究發現，CD58/CD2 相互作用是完全激活機體CD4+T 介導的體液免疫所必需的因素[19]，還有發現T 細胞中CD58 表達的降低與T 細胞介導的IL-2 和TNFα 產生的表達降低密切相關[20]。

圖6 CD58 在GSE16011 數據集中差異表達與生存差異情況

基于已有的研究方法和成果， 該研究通過生物信息學的方法篩選出與生存顯著相關的基因CD58，通過進一步分析TCGA 數據， 比較CD58 表達在非瘤腦組織與不同級別膠質瘤組織之間的表達差異，在P＜0.05 水平，發現了CD58 在非瘤腦組織和不同級別膠質瘤組織中存在不同表達， 在非瘤腦組織中呈低表達，在膠質瘤組織中高表達，并且其表達隨著膠質瘤惡性程度的增高而增高， 提取數據樣本的生存資料后通過分析發現在膠質瘤樣本中的CD58 表達水平越高，患者的生存時間越短，差異有統計學意義(P＜0.001)。 并且該研究采用外部數據庫GEO 中的GSE16011 數據集作為外部驗證數據，分析發現結果與TCGA 數據庫分析結果一致，進一步證實了CD58是具有上調意義的膠質瘤差顯基因。 并且CD58 在不同時間的AUC 值均高于0.7， 說明該基因預測能力強，CD58 極可能會成為膠質瘤輔助診斷的新型分子標志物和治療靶點。

綜上所述， 該研究發現CD58 可能對人腦膠質瘤的發生、 發展及預后具有重要作用，CD58 可以作為人腦膠質瘤診斷及預后評價的參考指標， 其有可能成為新的腦膠質瘤免疫治療靶點。 當然該研究僅基于生物信息學研究，尚缺乏臨床樣本的驗證，故該研究擬下一步進行臨床標本的相關試驗以驗證該研究結果。