肉桂提取物對阿爾茨海默病大鼠學習記憶和氧化應激水平的影響及機制

李冉 田子明

(焦作職工醫學院 1基礎教研室，河南 焦作 454000；2臨床部)

阿爾茨海默病(AD)又稱原發性老年癡呆，是一種在老年人中最常見的不可逆的神經退行性疾病，會損傷患者認知、行為和學習能力。該神經退行性疾病的病理特征為β-淀粉樣蛋白(Aβ)和過度磷酸化的tau聚集體，分別形成淀粉樣斑塊和神經原纖維纏結,從而引起神經元功能障礙和突觸可塑性受損。研究發現氧化應激和炎癥反應與Aβ有關〔1〕。肉桂為我國藥食同源的傳統藥物及香料，具有補火助陽、溫煦氣血、散寒止痛、溫通經脈等功效。現代藥理研究表明，肉桂含有揮發油、黃酮類、萜類等多種化學成分，具有擴張血管、抗胃潰瘍、抑菌、抗氧化等作用〔2〕。本文擬分析不同劑量肉桂提取物對AD模型大鼠學習記憶能力和氧化應激水平的作用。

1 材料與方法

1.1動物與分組 SPF級SD雄性大鼠，購于河南省實驗動物中心，許可證號：SCXK(豫)2017-0001。隨機數字表法將大鼠分為對照組，模型組，低、中、高劑量組和陽性藥物對照組，每組9只。

1.2主要藥品和試劑 肉桂購于亳州中藥材市場；吡拉西坦購于東北制藥集團沈陽第一制藥有限公司，國藥準字H21021775，規格：0.4 g×100片×1瓶/盒；Hoechst 33342溶液購于上海信裕生物科技有限公司；大鼠晚期糖基化終末產物(AGEs )酶聯免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒、大鼠丙二醛(MDA) ELISA試劑盒均購于上海瓦蘭生物科技有限公司；大鼠過氧化氫酶(CAT)ELISA試劑盒購于武漢菲恩生物科技有限公司；大鼠超氧化物歧化酶(SOD)ELISA試劑盒購于武漢益普生物科技有限公司；SOD1、SOD2、絡氨酸激酶受體(Trk)B、β-actin抗體均購于美國Cell Signaling Technology公司；腦源性神經營養因子(BDNF)、p-TrkB、NeuN、山羊抗兔IgG辣根過氧化物酶(HRP) 購于英國Abcam公司；二喹啉甲酸(BCA)蛋白濃度測定試劑盒購于北京索萊寶科技有限公司；電化學發光(ECL)檢測試劑盒購于愛必信(上海)生物科技有限公司。

1.3主要儀器 Varioskan LUX 多功能酶標儀〔賽默飛世爾科技(中國)有限公司〕；DMI6000B熒光顯微鏡(德國萊卡公司)；Gel Doc XR+全自動凝膠成像系統(美國Bio-Rad公司)；XR-XM101大小鼠Morris水迷宮(上海欣軟信息科技有限公司)。

1.4模型構建和分組 參照參考文獻〔3〕的方法構建AD大鼠模型。使用二甲基亞砜(DMSO)溶解Aβ25～35，置于37℃培養箱中老化處理7 d。使用10%水合氯醛麻醉大鼠，切開頭部皮膚，在海馬區位置緩慢注射Aβ25～35，術后縫合，在傷口處滴加青霉素防止傷口感染。對照組注射等量生理鹽水。

造模成功次日，低、中、高劑量組每日灌胃給藥終濃度分別為200、400和600 mg/kg肉桂提取物〔4〕。陽性藥物對照組采用0.5 g/kg吡拉西坦灌胃。對照組和模型組每日灌胃等量生理鹽水，連續灌胃60 d。

1.5Morris水迷宮實驗檢測各組學習記憶能力〔5,6〕在所有象限內提供均勻照明，并為大鼠提供固定的視覺線索。在水迷宮中注入清水，沒過平臺1 cm，加入適量二氧化鈦粉使水不透明。保持水池溫度在(22±2)℃。每只大鼠訓練2次/d，在連續訓練4 d后開始隱匿平臺獲得實驗，即將大鼠面向池壁從東、南、西、北4個象限中的任一方位入水點放入水池，記錄大鼠從入水至找到平臺的時間即為逃避潛伏期。未能在60 s內找到平臺的大鼠，將其引導至平臺并停留15 s，將其逃避潛伏時間記為60 s。每次更換入水象限進行測試，共測試4 d。在隱匿平臺獲得實驗結束后將平臺撤出，將大鼠放入水中90 s，測定大鼠游泳距離和進入平臺次數，確定到達準確平臺位置的延遲時間。每次訓練完成后將小鼠立即取出并擦干保溫以避免應激反應。

1.6ELISA試劑盒檢測AD大鼠氧化應激的影響 在行為學檢測后，處死大鼠，收集各組海馬組織，將海馬組織充分研磨勻漿，離心取上清，分別按照AGEs、MDA、CAT和SOD ELISA試劑盒說明書操作，檢測海馬組織中氧化應激相關指標。

1.7Western印跡檢測各組海馬組織中SOD1和SOD2表達情況〔7〕取大鼠海馬組織，液氮研磨，加入RIPA裂解液提取總蛋白，BCA試劑盒測定蛋白濃度。使用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離總蛋白，每孔蛋白質上樣量固定為30 μg。將分離的蛋白條帶轉移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上，5%脫脂奶粉封閉。TBST洗膜后，將PVDF膜放入一抗稀釋液〔SOD1(1∶1 000)、SOD2(1∶1 000)、β-actin(1∶1 000)〕中，4℃孵育過夜。棄去一抗稀釋液，TBST洗膜3次，每次10 min，加入二抗(1∶2 000)，室溫孵育1 h。使用ECL試劑盒顯影，全自動凝膠成像儀拍照，以β-actin為內參，計算SOD1蛋白和SOD2蛋白的相對表達量。

1.8免疫熒光檢測海馬組織中NeuN表達情況〔8〕將各組海馬組織使用4%多聚甲醛溶液固定，進行常規組織學操作，石蠟包埋切片，將切片貼在載玻片上，加入封閉溶液室溫封閉1 h。然后，將切片放置在一抗溶液(NeuN 1∶500)中，4℃孵育過夜，沖洗切片，加入二抗溶液室溫浸泡2 h。然后用Hoechst 33342溶液染色切片。沖洗蓋玻片3次，用甘油膠覆蓋，并在熒光顯微鏡下拍照觀察。

1.9Western印跡檢測各組BDNF/TrkB通路相關蛋白表達情況〔9〕取各組海馬組織進行Western印跡分析。使用SDS-PAGE分離蛋白，PVDF轉膜，封閉，加入一抗溶液(稀釋比例均為1∶1 000)，在4℃孵育過夜。洗膜后加入二抗溶液室溫下孵育2 h。顯影，拍照，計算蛋白表達水平。

1.10統計學方法 使用SPSS26.0軟件進行單因素方差分析、t檢驗。

2 結 果

2.1肉桂提取物對AD大鼠學習記憶功能的影響 模型組與對照組相比，游泳距離明顯增加，進入平臺次數明顯減少，延遲到平臺時間明顯增長，逃避潛伏期時間明顯增長(P<0.05)。與模型組比較，不同劑量組和陽性藥物對照組逃避潛伏期、游泳距離及延遲到平臺時間明顯縮短，進入平臺次數明顯增加(P<0.05)。見表1。

2.2肉桂提取物對AD大鼠氧化應激的影響 與對照組相比，模型組大鼠海馬組織中AGEs和MDA水平明顯升高，CAT和SOD水平明顯降低(P<0.05)。與模型組相比，低、中、高劑量組及陽性藥物對照組AGEs和MDA水平明顯降低，CAT和SOD水平明顯升高(P<0.05)。見表2。

2.3肉桂提取物對AD大鼠海馬組織SOD表達的影響 模型組海馬組織中SOD1和SOD2蛋白表達水平較對照組明顯降低(P<0.05)。與模型組相比，低、中、高劑量組及陽性藥物對照組明顯升高(P<0.05)。見圖1，表3。

表3 各組海馬組織中SOD1和SOD2蛋白表達水平比較

2.4肉桂提取物對AD大鼠海馬組織NeuN表達的影響 模型組NeuN表達水平〔(21.58±2.31)%〕較對照組〔(64.71±4.76)%〕明顯降低(P<0.05)。與模型組相比，肉桂提取物不同劑量組〔低、中、高劑量組(34.78±1.66)%、(38.82±2.19)%、(44.88±1.93)%〕和陽性藥物對照組〔(37.27±2.81)%〕均可明顯增加海馬組織中NeuN的表達。見圖2。

圖2 各組海馬組織中NeuN表達(免疫熒光，×100)

2.5肉桂提取物對AD大鼠海馬組織中BDNF/TrkB通路的影響 各組海馬組織中TrkB蛋白水平無明顯差異(P>0.05)。模型組海馬組織中BDNF和p-TrkB蛋白水平較對照組明顯降低(P<0.05)。與模型組相比，低、中、高劑量組和陽性藥物對照組BDNF和p-TrkB蛋白表達水平明顯升高(P<0.05)。見圖3，表4。

圖3 各組海馬組織中BDNF/TrkB通路相關蛋白表達水平比較

表4 各組海馬組織中BDNF/TrkB通路相關蛋白表達水平比較

3 討 論

AD是一種嚴重的神經退行性疾病，影響著全球大多數老年人。血腦屏障(BBB)是維持大腦結構和功能穩態微環境的必要條件〔10〕。研究發現，在AD病理過程中，氧化應激反應導致的小膠質細胞活化是活性氧簇(ROS)的主要慢性來源之一，從而導致神經毒性和BBB功能損害。Burak等〔11〕研究發現，肉桂可能是一種有前途的以炎癥和氧化應激增加為特征的治療神經退行性疾病的藥物，能夠在AD實驗模型中表現出顯著的促認知作用，包括氧化應激減少和顯著抑制β-分泌酶活性〔11〕。NeuN是一種位于神經元核內的特異性核蛋白，是在神經退行性疾病的研究中常用的量化正常神經元和識別神經元缺失的標志物，退化的神經元往往會失去這一標志物〔12〕。本實驗結果與前人的研究結果一致。

氧化應激是機體內ROS等自由基顯著增加，超過機體本身的清除能力，造成氧化系統和抗氧化系統失衡，最終造成細胞損傷或凋亡〔13〕。SOD1 是一種主要的抗氧化劑酶。SOD2是一種線粒體解毒酶，能催化超氧化物轉化為過氧化氫，可以保護細胞免受ROS的損害。SOD和CAT可以消除超氧化物和過氧化氫，MDA 可以反映氧化應激損傷的程度，其水平升高可以直接反映其遭受了過度的氧化應激損傷〔14〕。肉桂提取物可以明顯降低AD大鼠海馬組織中AGEs和MDA的產生和積累，增加CAT和SOD的活性；且隨著肉桂提取物所用劑量的提高，海馬組織中SOD1和SOD2蛋白表達水平也逐漸升高。王燕軍〔15〕研究發現，氧化應激與 BDNF 信號通路相互影響在糖尿病認知功能的病理發展中發揮重要作用。

有研究發現，BDNF/TrkB通路的激活，有助于改善AD大鼠的學習記憶能力〔16〕。BDNF是神經營養因子家族成員之一，在成熟后與激活TrkB結合并激活TrkB，參與神經細胞功能的調控，在AD的發病和發展中發揮重要作用〔17〕。本實驗中，肉桂提取物可以明顯升高BDNF和p-TrkB的表達水平，激活BDNF/TrkB通路，從而對AD模型大鼠的學習記憶能力起到改善作用。

綜上，肉桂提取物對AD模型大鼠的學習記憶能力具有一定改善作用，增強氧化應激能力，其作用機制主要與BDNF/TrkB通路的激活有關。