雙組分轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)CNX_RS34865/CNX_RS34870對(duì)安絲菌素生物合成的調(diào)控機(jī)制研究

張堃鈺 張佩佩 付加芳 康妮 宗工理 馬欣 張少偉 曹廣祥,*

(1 山東第一醫(yī)科大學(xué)(山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院)生物醫(yī)學(xué)科學(xué)學(xué)院，濟(jì)南 250117；2 山東省醫(yī)藥生物技術(shù)研究中心，濟(jì)南 250117)

珍貴束絲放線菌(Actinosynnema pretiosum)是一種重要的微生物資源，能產(chǎn)生大量的初級(jí)和次級(jí)代謝產(chǎn)物，對(duì)人類健康有著重要影響，其生長相關(guān)和代謝調(diào)控相關(guān)的機(jī)制也被廣泛地研究。A.pretiosumX47是安絲菌素的工業(yè)生產(chǎn)菌株，主要生產(chǎn)安絲菌素，還生產(chǎn)四氫異喹啉類生物堿化合物、環(huán)肽類化合物、含色氨酸的二酮哌嗪類化合物[1]和珍貴酚[2]等其他類型的化合物。安絲菌素是A.pretiosum產(chǎn)生的通過傳統(tǒng)工藝發(fā)酵而得到的一種美登素類抗生素的替代物，包括AP-1、AP-2、AP-3和AP-4 4種結(jié)構(gòu)類似物(圖1)，其中以AP-3活性最強(qiáng)，其作用機(jī)制主要是通過抑制細(xì)胞微管蛋白聚合和降解聚合后的微管[3]，從而抑制腫瘤細(xì)胞的生長來發(fā)揮抗腫瘤的活性，在臨床上主要用于乳腺癌的治療。AP-3同時(shí)也是開發(fā)抗體偶聯(lián)(antibody-conjugated，ADC)藥物的重要原料，然而國內(nèi)的AP-3發(fā)酵產(chǎn)量水平較低，在一定程度上限制其ADC藥物的研發(fā)。

目前A.pretiosumX47基因組的測(cè)序已完成[4]，其中AP生物合成包括兩個(gè)基因簇(圖2)：Cluster A和Cluster B。Cluster A主要編碼AP合成關(guān)鍵酶的基因，包括4個(gè)I型聚酮合成酶基因asmA-asmD、部分3-氨基-5-羥基苯甲酸(AHBA)合成相關(guān)基因asm22-asm25[5]、特殊延伸單元合成相關(guān)基因asm13-asm17[6]、后修飾相關(guān)基因asm27、asm10-12[7]、asm19[8]和asm21[9]和與轉(zhuǎn)運(yùn)或抗性基因相關(guān)的調(diào)控基因[10]。Cluster B主要編碼AHBA合成關(guān)鍵酶的基因，包括大部分AHBA合成相關(guān)基因asm43-asm45和asm47、調(diào)控基因asm39-asm40和asm48和一些可能的轉(zhuǎn)運(yùn)或抗性基因[7,11-12]。

雙組分轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)(two-component transduction system, TCS)是細(xì)菌當(dāng)中最重要的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)，能夠感知環(huán)境或營養(yǎng)成分變化，它們對(duì)微生物的初級(jí)代謝、次級(jí)代謝和形態(tài)分化具有全局性的調(diào)控作用。TCS由組氨酸激酶和響應(yīng)調(diào)控蛋白兩個(gè)組分組成：激酶緊貼最外層跨膜部分，負(fù)責(zé)感應(yīng)外界信號(hào)；響應(yīng)調(diào)控蛋白位于胞質(zhì)內(nèi)，接收激酶?jìng)鬟f的信號(hào)，發(fā)揮全局性的調(diào)控功能[13]。例如：在Streptomyces coelicolor中，TCS AfsQ1/Q2在特定的培養(yǎng)條件下激活次級(jí)代謝產(chǎn)物放線紫紅素、十一烷基靈菌紅素和鈣依賴性抗生素的合成[14]；Streptomyces albus中TCS RspA1/A2正調(diào)控鹽霉素的生物合成[15]。

深入的了解抗生素生物合成的調(diào)控機(jī)制是闡明抗生素合成途徑、提高抗生素產(chǎn)量的關(guān)鍵。在AP-3生物合成基因簇中，已有部分途徑特異性調(diào)控基因被研究，如asm2[16-17]、asm18[16]和asm39[17]等均被證實(shí)是AP-3生物合成的正調(diào)控基因。但尚未有全局性調(diào)控因子參與AP-3生物合成的研究報(bào)道。本研究發(fā)現(xiàn)A.pretiosumX47菌株中TCS CNX_RS34865/ CNX_RS34870正調(diào)控AP-3的生物合成。通過構(gòu)建CNX_RS34870基因的缺失突變菌株，比較分析AP-3產(chǎn)量差異及基因轉(zhuǎn)錄水平差異，探究CNX_RS34865/CNX_RS34870對(duì)AP-3生物合成的影響及作用分析機(jī)制，將為構(gòu)建AP-3高產(chǎn)菌株提供理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 菌株

珍貴束絲放線菌X47(Actinosynnema pretiosumX47)、Escherichia coliDH5α、E.coliET12567/pUZ8002及AP-3生物活性測(cè)定指示菌株指甲絨黑酵母菌(Filobasidium uniguttulatum)為本實(shí)驗(yàn)室保存。重組質(zhì)粒pJTU-D34870、缺失突變菌株ΔRS34870來源于本研究。

1.1.2 引物

本研究所用引物及序列見表1。

表1 本研究所用引物及序列Tab.1 Primers and sequences used in this study

1.2 方法

1.2.1 ΔRS34870菌株的構(gòu)建

以A.pretiosumX47的基因組為模板，以CNX_RS34870 L-F/L-R和CNX_RS34870 R-F/R-R為引物，分別擴(kuò)增待缺失片段的上下游片段(L和R)；以pSET152質(zhì)粒為模板，利用Apra F/R為引物，擴(kuò)增阿伯拉霉素抗性基因片段(apramycin resistance cassette)。通過同源重組的方法將上游片段、阿伯拉霉素抗性基因片段以及下游片段連接至pMD-18T載體，得到重組質(zhì)粒pMD-D34870，然后對(duì)其進(jìn)行HindⅢ和XbaⅠ雙酶切，將酶切得到的片段連接到pJTU1278載體上構(gòu)建重組質(zhì)粒pJTU-D34870；最后將其轉(zhuǎn)化入E.coliET12567/pUZ8002感受態(tài)細(xì)胞得到E.coliET12567-D34870菌株。

將E.coliET12567-D34870接種于含氨芐西林(終濃度為50 μg/mL)和卡那霉素(終濃度為50 μg/mL)的LB培養(yǎng)基(氯化鈉 1%、酵母提取物 0.1%、胰蛋白胨1%)中，37℃，培養(yǎng)至A600為0.4～0.6，然后用無菌LB培養(yǎng)基重懸菌體3～4次作為供體菌備用。將A.pretiosumX47的孢子混懸液加入到2×YT培養(yǎng)基(酵母提取物1%、酪蛋白氨基酸1%、氯化鈣0.11%)中，50℃熱擊10 min后自然冷卻至室溫，然后用無菌LB培養(yǎng)基重懸孢子3～4次作為受體菌備用。將供體菌與受體菌混合后涂布于MS培養(yǎng)基(大豆粉2%、甘露醇2%、瓊脂粉2%，pH7.0)，30 ℃恒溫培養(yǎng)20 h后覆蓋阿伯拉霉素(終濃度為10 μg/mL)和萘啶酮酸(終濃度為15 μg/mL)，繼續(xù)培養(yǎng)4～5 d即可長出接合子。在含有阿伯拉霉素(終濃度為10 μg/mL)的ISP2培養(yǎng)基(酵母提取物 0.4%、麥芽提取物 1%、葡萄糖 0.4% 、瓊脂粉2% ，pH7.0)上對(duì)接合子進(jìn)行劃線傳代培養(yǎng)，利用引物RS34870 V-F/R對(duì)接合子進(jìn)行PCR驗(yàn)證，篩選獲得CNX_RS34870基因的缺失突變菌株ΔRS34870。

1.3 AP-3的發(fā)酵產(chǎn)量分析

1.3.1 AP-3的發(fā)酵及萃取

分別將X47和ΔRS34870的孢子(106個(gè)/mL)接種于種子培養(yǎng)基(葡萄糖2%、可溶性淀粉4%、豆餅粉1%、聚蛋白胨0.5%、氯化鈉0.3%、無水氯化鈣0.5%，pH7.0)，28℃，220 r/min搖瓶培養(yǎng)48 h，以5%的接種量接入發(fā)酵培養(yǎng)基(麥芽糊精3%、可溶性淀粉3%、麥芽浸粉1%、聚蛋白胨0.5%、無水氯化鈣1%，pH7.0)，28℃，220 r/min 搖瓶培養(yǎng)7 d。得到的發(fā)酵液用等體積的乙酸乙酯超聲萃取2次，將萃取液蒸干，加入甲醇溶解殘留物，得到AP-3樣品[18]。以上步驟重復(fù)3次，取其平均值用于AP-3的發(fā)酵產(chǎn)量分析。

1.3.2 HPLC分析

用0.22 μm濾膜過濾含有AP-3的甲醇(CH3OH)溶液，取20 μL進(jìn)行HPLC檢測(cè)。HPLC檢測(cè)條件為[18]：安捷倫1260高效液相色譜儀(美國Agilent公司)；Diamonsil C18反相色譜柱(250 mm×4.6 mm)；柱溫：40℃；檢測(cè)波長：254 nm；進(jìn)樣量：20 μL；流速：0.6 mL/min；洗脫條件：0～3 min：80% H2O，20% CH3OH；3～20 min：50% H2O，50% CH3OH；20～26 min：10% H2O，90% CH3OH；26～30 min：80% H2O，20% CH3OH。AP-3保留時(shí)間在17.9 min。

1.3.3 生物活性測(cè)定分析

以F.uniguttulatum為生物活性測(cè)定指示菌株[12]，檢測(cè)X47和ΔRS34870菌株的安絲菌素的合成情況。將F.uniguttulatum菌株接種于YPD培養(yǎng)基(酵母提取物1%、聚蛋白胨2%和葡萄糖2%)，28℃，220 r/min培養(yǎng)60 h后作為指示菌加入42℃的未凝固YPDA固體培養(yǎng)基中，混合均勻后制成平板。將無菌的8 mm直徑圓形濾紙片分散置于生物活性測(cè)定平板上，分別向?yàn)V紙片上加入5 μL AP-3樣品，風(fēng)干后置于28℃下培養(yǎng)8～12 h，觀察抑菌圈直徑。

1.4 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序及數(shù)據(jù)分析

菌株X47和ΔRS34870在發(fā)酵培養(yǎng)基培養(yǎng)72 h后，分別收集菌體進(jìn)行轉(zhuǎn)錄水平分析。提取菌體總RNA，質(zhì)量檢測(cè)合格后由測(cè)序公司(北京諾禾致源生物信息科技有限公司)進(jìn)行基因組測(cè)序。根據(jù)測(cè)序結(jié)果比較分析X47與ΔRS34870菌株中基因的轉(zhuǎn)錄水平變化。

2 結(jié)果

2.1 TCS CNX_RS34865/CNX_RS34870的分析鑒定

通過序列分析發(fā)現(xiàn)，在A.pretiosumX47菌株基因組中存在兩個(gè)相鄰的基因CNX_RS34865和CNX_RS34870。其中CNX_RS34865基因全長1126 bp，編碼一個(gè)組氨酸激酶；CNX_RS34870基因全長676 bp，編碼響應(yīng)調(diào)控蛋白，包含1個(gè)LuxR家族的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域。因此，初步推測(cè)CNX_RS34865/CNX_RS34870為一對(duì)TCS，可能參與初級(jí)代謝或次級(jí)代謝的調(diào)控。

2.2 CNX_RS34870缺失突變菌株的構(gòu)建及表型分析

通過PCR獲得CNX_RS34870基因的上游1656 bp的DNA片段和下游1457 bp的DNA片段，并采用在上下游片段之間連接1100 bp的阿伯拉霉素抗性基因片段替換目的基因，得到敲除質(zhì)粒pJTU-D34870(圖3A)。該質(zhì)粒經(jīng)酶切后電泳檢測(cè)得到9237 bp的載體條帶和4213 bp的插入片段(圖3B)。通過接合轉(zhuǎn)移得到接合子后進(jìn)行PCR檢測(cè)，結(jié)果見圖3C，以X47菌株基因組為模板時(shí)，DNA片段為774 bp，而以ΔRS34870菌株為模板時(shí)，DNA片段為1488 bp，與預(yù)期值相符。同時(shí)分別將X47菌株和ΔRS34870菌株涂布于ISP2培養(yǎng)基上，觀察二者的生長狀態(tài)。結(jié)果顯示兩者的生長速度及表型一致(圖3D)，說明缺失CNX_RS34870基因不影響A.pretiosumX47的生長。

2.3 菌株AP-3的產(chǎn)量分析

將A.pretiosumX47與ΔRS34870菌株進(jìn)行液體發(fā)酵，分別在2～7 d利用HPLC分析AP-3的產(chǎn)量。結(jié)果如圖3A所示，X47菌株在第2天開始產(chǎn)生AP-3，第6天的AP-3產(chǎn)量達(dá)到14.59 mg/L；而ΔRS34870菌株在第2天幾乎檢測(cè)不到AP-3的合成，第6天的AP-3產(chǎn)量達(dá)到9.2 mg/L，較同期X47菌株AP-3產(chǎn)量降低了36.94%(圖4A和4B)。同時(shí)，將得到的X47與ΔRS34870菌株在第6天的AP-3產(chǎn)物進(jìn)行生物活性檢測(cè)， X47與ΔRS34870菌株發(fā)酵產(chǎn)物的抑菌圈直徑分別為0.95和0.49 cm(圖4C)，與HPLC結(jié)果一致。以上結(jié)果說明CNX_RS34870基因的缺失顯著影響菌株AP-3的產(chǎn)量，提示CNX_RS34870基因正調(diào)控AP-3的生物合成。

2.4 轉(zhuǎn)錄分析基因表達(dá)差異

分別對(duì)X47與ΔRS34870菌株發(fā)酵72 h的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)行測(cè)序分析。與X47菌株相比，ΔRS34870菌株中共有1524個(gè)基因轉(zhuǎn)錄水平發(fā)生顯著變化，其中242個(gè)基因表達(dá)上調(diào)，1282個(gè)基因表達(dá)下調(diào)(圖5A)。這些變化的基因主要參與菌株糖酵解途徑、脂肪酸途徑、氨基酸代謝途徑、糖代謝途徑和丙酮酸代謝途徑等初級(jí)代謝活動(dòng)，以及安絲菌素生物合成等多種生命活動(dòng)(圖5B)。

進(jìn)一步的數(shù)據(jù)分析結(jié)果(表2)顯示，ΔRS34870菌株中AP-3生物合成基因簇A中的結(jié)構(gòu)基因asm1、asm30、asm32、asm33、asm35和asm37的轉(zhuǎn)錄水平出現(xiàn)顯著下調(diào)；調(diào)控基因asm2和asm34也出現(xiàn)了不同程度的下調(diào)。根據(jù)以上結(jié)果推測(cè)CNX_RS34870基因通過調(diào)控上述基因的轉(zhuǎn)錄影響AP-3的生物合成。

表2 X47與 ΔRS34870 菌株中AP-3 生物合成基因簇基因轉(zhuǎn)錄水平差異Tab.2 Transcriptional differences of AP-3 biosynthetic gene cluster between X47 and ΔRS34870 strains

另外，部分與初級(jí)代謝相關(guān)的基因也出現(xiàn)了顯著變化。如莽草酸途徑基因pgk等。pgk編碼磷酸甘油酸激酶，在莽草酸途徑中將甘油酸-1,3-二磷酸轉(zhuǎn)化為丙酮酸，而丙酮酸是AP-3生物合成途徑中前體物質(zhì)丙二酰輔酶A合成的關(guān)鍵物質(zhì)，因此pgk基因的轉(zhuǎn)錄會(huì)影響AP-3的生物合成[19]。因此推測(cè)CNX_RS34870基因可通過調(diào)控與初級(jí)代謝相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄間接影響AP-3的生物合成。但CNX_RS34870基因直接調(diào)控的靶基因仍有待通過染色質(zhì)免疫共沉淀和電泳遷移率分析等試驗(yàn)進(jìn)一步闡釋。

3 結(jié)論

放線菌中抗生素的合成受到多層次的調(diào)控，關(guān)鍵調(diào)控基因的表達(dá)水平的變化可顯著影響抗生素的合成。本研究側(cè)重于菌株AP-3生物合成的全局性調(diào)控研究，以A.pretiosumX47菌株為研究對(duì)象，提示TCS CNX_RS34865/CNX_RS34870中調(diào)控蛋白CNX_RS34870正調(diào)控AP-3的生物合成。CNX_RS34870基因缺失后，AP-3的產(chǎn)量顯著下降。本研究將為深入了解AP-3生物合成的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)以及工業(yè)菌株的遺傳改造提供理論指導(dǎo)。

轉(zhuǎn)錄水平分析顯示CNX_RS34870正調(diào)控AP-3生物合成基因簇中結(jié)構(gòu)基因asm1、asm30、asm32、asm33、asm35和asm37以及調(diào)控基因asm2和asm34的轉(zhuǎn)錄，同時(shí)調(diào)控初級(jí)代謝相關(guān)基因pgk的轉(zhuǎn)錄，說明RS34870對(duì)AP-3生物合成可能是通過全局的、多方面的調(diào)控作用來實(shí)現(xiàn)的。另外，CNX_RS34870基因缺失后，菌株的糖酵解途徑、脂肪酸途徑、氨基酸代謝途徑、糖代謝途徑和丙酮酸代謝途徑等相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄水平均出現(xiàn)了顯著變化，提示CNX_RS34870對(duì)A.pretiosum具有廣泛的調(diào)控作用，但其具體的調(diào)控功能及作用機(jī)制有待進(jìn)一步研究。