硅藻定量檢驗和種屬鑒定的實驗研究

楊麗

摘要：硅藻檢驗在診斷溺死方面是一種相對可靠的方法。本文簡述了硅藻檢驗在死因診斷中的應用，通過對其檢驗方法進行優缺點的探討，對檢驗中的問題以及發展的方向進行了分析，以期對鑒定溺死提供借鑒。

關鍵詞：硅藻;溺死;檢驗;種屬

藻檢驗可以為尸體死因以及死亡的方式提供有力的依據，是當前診斷溺死的一個重要的檢驗方法，在對污染進行了嚴格控制的前提下，硅藻檢驗可以作為診斷溺死的金標準[1-2]。

1硅藻的生物學特征

硅藻屬于單細胞藻類，在自然界的水域中廣泛存在。硅藻種類繁多，各種藻類在水體中的分布會隨著環境的不同呈現出種群上的差異，同時還會受到溫度、季節以及光照等因素的影響。硅藻細胞的直徑一般為1-600μm之間，體積差異非常明顯。硅藻相對于其他藻類，有其自身的特殊性：首先是硅藻體外有一層硅質殼，是由果膠和硅質組成，由細胞壁硅質化生成;其次是不同種類的硅藻有不同的標志性特點，可以依據硅藻形態及紋飾上的區別來對其進行區分[3-4]。

2硅藻的檢驗方法

目前在硅藻檢驗時，其方法可以大致分成三個類型，即化學元素法、消化法和DNA檢測法。

2.1化學元素法

這種方法采用紫外線的方式，激發硅藻體內的葉綠素a產生出一定量的熒光，由此計算出浮游生物的總體含量。這種檢測方法成本低，對環境等的污染比較小，且操作非常簡單。

2.2無機消化法

在早期對硅藻進行檢測有一系列方法，例如有離心法、浸漬法、焚燒法等，而1937年由Kasparek創建的濃硝酸法則成為了無機消化法的基礎。在此基礎上，又出現了許多新的檢測方法，例如，采用微波加熱和可以控制壓力的消解罐可以組成微波消解儀，研發人員由此研發了微波消解掃描電鏡聯用法，這種方法能夠讓有機物能夠更好地被消解，對于硅藻檢出率有了較大的提高，得到了廣泛地使用。但是這種檢驗的成本是比較高的，檢驗的周期較長，對于技術人員的專業技能要求較高，難以在基層進行推廣和應用。王玉仲等[5]對此方法進行了優化，將濾膜透明化，即可在普通的顯微鏡下來觀察硅藻，讓檢測成本大幅下降。

2.3有機消化法

有機消化法在檢測的過程中對于硅藻的破壞較小，可以保留硅藻的核酸物質，后期可以對硅藻進行各項分子生物學方面的檢測，但是其消化環節還需要進行進一步的優化。有機消化的方式有兩種：一是適用于檢測淡水中硅藻的Soluene-350法，同時添加超聲波加熱的環節能夠將試驗時間縮短;二是利用酶來進行消化的方法，其方法在檢測過程中采用了SDS和蛋白酶K來對組織進行酶消化，能夠檢測出樣品當中的硅藻和一些浮游生物，同時不會對硅藻進行較大程度的破壞。

2.4分子生物學檢驗方法

何方鋼等[6]研究表明，對硅藻的16SrDNA進行檢測，能夠為案件中溺死的地點提供重要的依據;zhao等[7]利用對硅藻18SrDNA的部分區域進行測序，進而對硅藻進行分類，為工作人員判斷溺水者的溺水位置提供依據;采用PCR-DHPLC法來對硅藻進行檢測，能夠確定硅藻的種類，與消化檢測法相比，其檢出率更高，同時對于樣品量的需求更低。

rbcL基因是控制葉綠體進行光合作用的關鍵基因，因此檢測rbcL基因在推斷溺死地點的工作中也有較好的開發前景。Kathleen[8]等針對rbcLjiyin 開發了相關引物，檢測出了許多找見的硅藻。

3檢測中存在的問題及展望

3.1硅藻種屬的判斷

將消化檢測法和對硅藻進行形態學上的觀測進行結合，就能夠對硅藻的具體種類進行判斷。但是消化法在檢測過程中會對后續的形體觀察造成一定程度的影響。例如在進行無機消化的過程中，會對硅藻的具體形態造成破壞，而有機消化則可能會對樣品的消化不完全，導致一些硅藻被掩藏而遺漏這部分硅藻。

3.2硅藻的定量檢測

在具體的檢測過程中，尸體的各個器官中硅藻含量的檢測對于溺死的定性來說非常關鍵，但是目前實行的檢測在實際工作中存在一些困難。例如在消化法中，由于無機消化的過程造成了硅藻的破壞，一些破碎的硅藻難以被統計，同時若采用肉眼觀察的方法，則可能會產生人為誤差，對于硅藻數量的統計會與真實值產生一定的差異。而在有機消化的過程中對樣品的消化不完全，因此在進行數量統計時可能會造成遺漏。如何在保證硅藻形態完整性的情況下建立起掃描統計將成為后續發展的方向。

3.3硅藻的DNA檢測方法

分子生物學檢測在未來有著良好的發展前景：首先目前對于硅藻的檢測大部分是檢測共性DNA，下一步可以開發種屬特異性的檢測方法;其次由于溺死的尸體中DNA可能會降解，因此改良硅藻DNA提取和純化的發展，提高DNA的檢出率也是將來的發展方向。

4小結

硅藻檢驗在應用中有非常大的意義，目前這種方法檢測的成本較高，對于專業技術人員的要求高，檢驗時間較長，且存在檢驗的方法不成熟，造成環境污染等問題，但是這種方法已經成為相關部門的一種重要檢測方法，能夠為案件的偵辦提供證據和線索，因此后續需要對這種檢測技術進行優化和完善。

參考文獻：

[1]. 小泉格， 王開發與郭蓄民， 硅藻. 1984： 地質出版社.

[2]. 王玉仲，趙建，李鵬，等. 三種硅藻檢驗方法比較[J]. 南方醫科大學學報，2015，35（3）：427-431.

[3] 何方剛，黃代新，劉良，等 .PCR-DGGE 法檢測浮游生物16S rDNA 在溺死鑒定中的應用[J]. 中國法醫學雜志， 2008（4）：234-237.

課題項目：2020年度校級中青年科研基金項目，安徽省內長江流域硅藻分布及其變化規律的研究（課題編號WK202004）F25EF4B3-26D4-4962-84E2-F4964BD4C901