有氧跑臺運動調控葡萄糖轉運蛋白9對高尿酸血癥大鼠腎臟功能的影響

梁家榕，楊 煥，寸勇丹，王麗歡，李儀杰，葉 斌

云南中醫藥大學第二臨床醫學院，云南 昆明 650500

高尿酸血癥（hyperuricemia，HUA）是導致慢性腎臟損傷［1］、代謝綜合征［2］、痛風［3］、高血壓［4］等疾病的重要危險因素，而嘌呤代謝異常［5］和尿酸排泄［6］不足所導致的血尿酸升高是其發病基礎。近年來，隨著富含嘌呤食物攝入量的逐漸增加，我國HUA的發病率逐年增高［7］。研究指出，截至2017年底中國HUA確診病例已達到1.7億例，其中女性發病率為7.9%，男性發病率為19.4%［8］。目前臨床治療HUA主要采用別嘌醇、非布司他、苯溴馬龍等藥物控制，雖有一定效果，但存在誘發痛風急性癥狀、損傷肝腎組織和停藥易復發等副作用［9］。因此，尋找一種副作用小且療效顯著的治療方法一直是臨床關注的重點。近年來，“運動是良醫”的觀念已深入人心［10］，科學合理的運動可以有效預防疾病、提高生活質量。實驗研究顯示運動療法可以治療代謝性疾?。?1-12］。臨床研究顯示，有氧運動可以起到增加脂肪代謝、降低血尿酸等作用［13-14］。目前關于有氧運動可以改善HUA患者血尿酸水平的機制研究主要集中于調控尿酸轉運體三磷酸腺苷結合盒轉運蛋白G2［ATP-binding cassette superfamily G（White）member 2，ABCG2］［15］，但ABCG2是通過調節腎臟排泄尿酸，還是促進腎臟尿酸重吸收尚不明確。葡萄糖轉運蛋白9（glucose transporter 9，GLUT-9）作為腎臟組織中廣泛表達的葡萄糖轉運蛋白家族的成員之一，在尿酸（uric acid，UA）的重吸收過程中具有不可或缺的作用［16］。本研究嘗試通過實驗研究驗證有氧運動是否通過調節腎臟尿酸重吸收以達到降低HUA患者血尿酸的作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

選擇SPF級雄性SD大鼠24只，6～8周齡，初始體質量200～220 g，由湖南斯萊克景達實驗動物有限公司提供，實驗動物質量合格證編號：SYXK（滇）K2017-0005，實驗動物生產許可證編號：SCXK（湘）2019-0004。每籠4只，自由飲食、飲水，飼養環境溫度20～25℃，濕度50%～60%，人工光照12 h∶12 h明暗交替（8∶00—20∶00），更換墊料1次/2 d。本次動物實驗嚴格遵循動物倫理原則，經云南中醫藥大學實驗動物倫理委員會批準（審批號：R-062021006）。

1.2 主要實驗試劑與設備

氧嗪酸鉀（上海源葉生物科技有限公司，S17112）；尿酸（uric acid，UA）試劑盒、肌酐（creatinine，Cre）試劑盒、尿素氮（blood urea nitrogen，BUN）試劑盒（南京建成科技有限公司，貨號：C012-2-1、C011-2-1、C013-2-1）；大鼠白細胞介素1β（interleukin-1β，IL-1β）ELISA試劑盒（江蘇酶免實業有限公司，MM-0047R1）；Caspase-1、IL-1β、GLUT-9抗體（武漢三鷹生物技術有限公司，貨號：22915-1-AP、16806-1-AP、26486-1-AP）；4%多聚甲醛溶液（武漢賽維爾生物科技有限公司，G1101）；臺式高速低溫離心機（德國Hettich科學儀器有限公司，Mikro185型）；-80℃超低溫冰箱（中國海爾集團公司，DW-86L828J型）；氣體麻醉機（北京眾實迪創科技發展有限責任公司，ZS-MV-IDV型）；全波長酶標儀（瑞士Tccan有限公司，SPARK10M型）；熒光及化學發光成像系統（上海勤翔科學儀器有限公司，ChemiScope 6000 pro型）；冰凍切片機（北京萊比信儀器有限公司，MEV型）；倒置熒光顯微鏡成像系統（上海尼康儀器有限公司，Ti-S型）；動物實驗跑臺（上海繼德教學實驗器材廠，JD-PT型）；實驗室純水機（重慶華創水處理工程有限公司，GYJ1-10L-S型）。

1.3 實驗方法

1.3.1 實驗動物分組及模型制備 將24只雄性SD大鼠編號，采用Excel生成隨機數字表（1～8），任意選擇隨機數字表中的一個數字作為起始點并對應大鼠編號1，從左到右、自上而下分別對應1～24號大鼠。用隨機數字除以3所得到的余數以確定每只大鼠的分組，余數0、1、2分別對應對照組、模型組和有氧跑臺運動組（運動組），每組8只。

每天9∶00，對照組按照劑量2 g/（kg·d）蒸餾水灌胃；模型組、運動組采用氧嗪酸鉀（oxonic aid potassium salt，OAPS）灌胃造模，劑量2 g/（kg·d），連續灌胃造模10 d，第10天灌胃結束后1 h，大鼠眼眶后靜脈叢取血檢測血UA含量，若模型組、運動組血UA濃度比對照組血UA濃度明顯升高（P＜0.05），則表示HUA大鼠模型造模成功［17］。

1.3.2 干預方法

1.3.2.1 對照組 第11天起，對照組改為隔天9∶00蒸餾水灌胃。不限制飲食及飲水，鼠籠中自由運動，不進行其他干預，共持續3周。

1.3.2.2 模型組 第11天起，模型組改為隔天9∶00 OAPS灌胃以維持干預期間持續高尿酸狀態，劑量為2 g/（kg·d），不限制飲食及飲水，鼠籠中自由運動，不進行其他干預，共持續3周。

1.3.2.3 運動組 第11天起，運動組改為隔天9∶00 OAPS灌胃以維持干預期間持續高尿酸狀態，劑量為2 g/（kg·d）。每天10∶00將其放入實驗動物跑臺中進行有氧跑臺運動訓練，速度12 m/min，20 min/次，1次/d，每周訓練6 d，休息1 d，持續3周。

1.4 觀察指標

1.4.1 腎臟病理學改變 處理后的大鼠，仰臥位放置于解剖臺上，打開腹腔摘取腎臟組織，剝去腎臟組織被膜，左腎放入凍存管中，于-80℃冰箱冷凍保存；右腎經4%多聚甲醛固定，樣本固定狀態良好后，分別將樣本放入80%、90%、95%、100%不同濃度乙醇中脫水2 h，脫水后的組織浸入蠟塊包埋，將含有組織的蠟塊放入切片機中，調整切片厚度15μm。蠟帶平鋪在載玻片上后放入恒溫烘箱內脫去并熔化組織間隙的石蠟。制備好的石蠟切片經過二甲苯脫蠟后，采用蘇木精-伊紅染色法（hematoxylineosin staining，HE）進行染色。首先，將脫蠟后的切片放入100%、90%、80%、70%不同濃度乙醇浸泡5 min，蘇木精染色5 min后，5%乙酸分化1 min，伊紅染色1 min，再進行70%、80%、90%、100%乙醇清洗10 s，二甲苯浸泡1min后通風處風干5 min，封片，顯微鏡（×400）下拍照，觀察腎臟組織腎小管及腎小球結構變化。

1.4.2 腎臟功能檢測 3組末次干預結束后1 h，采用腹腔注射戊巴比妥鈉麻醉過量處死所有大鼠，待大鼠死亡后，仰臥位放置于解剖臺上，打開胸腔暴露心臟，采用10 mL一次性注射器從大鼠心尖部快速抽取約5 mL心尖血，室溫下靜置1 h，于離心機上離心（3 500 r/min，20 min，-4℃），取上層血清，用于檢測UA、肌酐（creatinine，Cre）、尿素氮（blood urea nitrogen，BUN）等腎臟功能指標。將UA、Cre和BUN試劑盒從冰箱中取出在室溫環境下放置20 min；將所有血清樣本及標準品加入離心管中；按照說明書步驟操作，在酶標儀690 nm波長下測定各孔的吸光度。

1.4.3 血清、腎臟炎性因子含量 將5 mL大鼠心尖血液放入低溫高速離心機中，3 500 r/min，4℃，離心20 min，將離心出的血清轉移至新的離心管-80℃冷凍保存。準確稱取腎臟組織質量，按照1∶9比例加入9倍腎臟組織體積的磷酸鹽緩沖溶液（phosphate buffer saline，PBS），放入高速低溫自動研磨儀中研磨2 min，制備成10%勻漿液，3 500 r/min，離心10 min，取上清液測定。將ELISA試劑盒從冰箱中取出放置于室溫下20 min；加樣后將酶標板放置于37℃培養箱中孵育30 min；洗板5次后每孔加入酶標試劑50μL；再次37℃培養箱中孵育30 min；每孔加入顯色液A、B各50μL；避光37℃培養箱中孵育10 min；每孔加入終止液50μL在酶標儀450 nm波長下測定各孔吸光度，根據各濃度標準品所制作的標準曲線得出公式并將各孔吸光度值代入公式計算出每個樣本中白介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）的含量。

1.4.4 腎臟組織蛋白表達 采用Western blot法檢測腎臟組織中半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶1（cysteinyl aspartate specific proteinase 1，Caspase-1）、IL-1β和GLUT-9的表達。每個樣本（約0.03 g）中加入700μL細胞裂解液，冰上操作研磨5 min，離心后取上清，并進行蛋白定量；加入Marker及蛋白樣本；80 V電壓電泳30 min后轉為120 V電泳1 h，剪裁大小適合聚偏氟乙烯（Poly vinylidene fluoride，PVDF）膜進行轉膜，300 mA電流轉膜1 h。棄去膠塊，裁剪出相應蛋白分子量所在的條帶，用5%脫脂奶粉室溫下封閉2 h。TBST緩沖液洗膜3次，5 min/次，配置抗Caspase-1、IL-1β和GLUT-9抗體（1∶500）進行孵育，過夜。次日，一抗回收，TBST緩沖液洗膜，二抗（1∶2 000）室溫下孵育1 h，TBST緩沖液洗膜3次，配置ECL底物發光液。采用ChemiScope 6000 pro成像分析系統曝光掃描，將檢測得出的目標條帶及內參條帶灰度值進行比較得出比值。

1.5 統計學方法

采用SPSS25.0軟件進行數據分析，采用Graphpad Prism 7.04軟件繪制統計圖。數據符合正態分布，采用（±s）表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較方差齊采用LSD-t檢驗，方差不齊則采用Dunnett's T3檢驗。P＜0.05表示差異具有統計學意義。

2 結 果

2.1 3組腎臟組織病理變化

HE染色病理分析結果顯示，對照組腎臟組織未見明顯病理改變；模型組腎臟組織被膜不完整，腎小球變形萎縮，腎小管排列紊亂，上皮細胞胞質出現空泡化，腎小管間質內大量炎性細胞浸潤，局部間質內細胞點狀壞死，可見核固縮、崩解和碎裂，血管周圍纖維組織增生，見細胞核呈長梭形或長橢圓形的成纖維細胞增多；運動組腎臟組織炎性細胞浸潤數量明顯減少，腎小管結構較為完整，腎小管上皮細胞胞質空泡化等病理改變明顯減輕。見圖1。

圖1 3組腎臟組織病理變化圖（×400）Figure 1 Pathological changesof kidney tissues in three groups(×400)

2.2 3組血清UA、Cre、BUN含量比較

與對照組比較，模型組、運動組血清UA、BUN和Cre水平明顯升高（P＜0.05）；與模型組比較，運動組血清UA、BUN和Cre水平明顯降低（P＜0.05）。見表1。

表1 3組血清UA、BUN、Cre含量比較（±s） μmol/LTable1 Comparison of serum UA，BUN，and Cre contents in three groups（±s） μmol/L

表1 3組血清UA、BUN、Cre含量比較（±s） μmol/LTable1 Comparison of serum UA，BUN，and Cre contents in three groups（±s） μmol/L

注：與對照組比較，1）P＜0.05；與模型組比較，2）P＜0.05。Note:Compared with the Contorl group,1)P＜0.05;compared with the Model group,2)P＜0.05.

組別對照組模型組運動組n8 8 8血清UA濃度108.17±14.79 355.44±52.901）267.52±64.441）2）血清BUN濃度20.97±1.78 40.87±2.321）32.19±2.041）2）血清Cre濃度38.97±6.81 68.85±8.191）57.35±8.271）2）

2.3 3組血清及腎臟IL-1β含量比較

與對照組比較，模型組、運動組大鼠血清和腎臟中IL-1β的表達水平明顯升高（P＜0.05），與模型組比較，運動組大鼠血清和腎臟組織中IL-1β明顯降低（P＜0.05）。見表2。

表2 3組血清及腎臟IL-1β含量比較（±s）Table2 Comparison of IL-1βcontent of serum and renal in three groups（±s）

表2 3組血清及腎臟IL-1β含量比較（±s）Table2 Comparison of IL-1βcontent of serum and renal in three groups（±s）

注：與對照組比較，1）P＜0.05；與模型組比較，2）P＜0.05。Note:Compared with the Contorl group,1)P＜0.05;compared with the Model group,2)P＜0.05.

組別對照組模型組運動組n 8 8 8血清IL-1β含量/（ng/L）16.39±1.71 31.32±1.731）28.12±3.091）2）腎臟組織IL-1β含量/（ng/g）0.14±0.04 0.28±0.041）0.21±0.041）2）

2.4 3組Caspase-1、IL-1β、GLUT-9蛋白表達水平比較

與對照組比較，模型組、運動組腎臟組織中Caspase-1、IL-1β和GLUT-9的蛋白表達明顯升高（P＜0.05）；與模型組比較，運動組大鼠腎臟組織中Caspase-1、IL-1β和GLUT-9蛋白表達明顯降低（P＜0.05）。見表3、圖2。

表3 3組Caspase-1、IL-1β和GLUT-9蛋白表達比較（±s）Table 3 Comparison of caspase-1，IL-1βand GLUT-9 protein expression in three groups（±s）

表3 3組Caspase-1、IL-1β和GLUT-9蛋白表達比較（±s）Table 3 Comparison of caspase-1，IL-1βand GLUT-9 protein expression in three groups（±s）

注：與對照組比較，1）P＜0.05；與模型組比較，2）P＜0.05。Note:Compared with the Contorl group,1)P＜0.05;compared with the Model group,2)P＜0.05.

組別對照組模型組運動組n 8 8 8 Caspase-1蛋白1.00±0.00 1.77±0.251）1.40±0.071）2）IL-1β蛋白1.00±0.00 1.53±0.141）1.25±0.161）2）GLUT-9蛋白1.00±0.00 1.70±0.211）1.29±0.231）2）

圖2 3組Caspase-1、IL-1β和GLUT-9蛋白電泳圖Figure 2 Protein electrophoresisof Caspase-1,IL-1βand GLUT-9 in three groups

3 討 論

本研究結果顯示，與模型組比較，運動組血清UA、Cre、BUN、IL-1β含量均出現明顯降低。這提示，有氧跑臺運動訓練可以降低OAPS誘導的高尿酸血癥模型大鼠尿酸和炎癥水平，改善腎臟損傷。此外，結果顯示，與模型組比較，運動組Caspase-1、IL-1β、GLUT-9蛋白表達明顯降低，這提示有氧跑臺運動訓練可以下調Caspase-1、IL-1β和GLUT-9蛋白表達，促進尿酸的重吸收并減輕HUA大鼠腎臟的炎癥反應以實現腎臟保護作用。這可能與以下因素有關：①HUA患者體內血UA濃度長期處于較高的水平，而UA主要由腎臟排泄，UA排泄不足會導致腎臟損傷，而有氧運動可以加速血液循環，促進機體新陳代謝，加速HUA患者體內UA排泄，改善腎臟功能［17-18］。這與SUN等［14，19-20］研究發現12周的有氧訓練可有效降低慢性病患者血尿酸、血糖等生化指標的結果一致。②炎癥反應是HUA腎臟損傷的關鍵病理過程，HUA患者體內可析出UA晶體，而該晶體可激活含NLR家族PYRIN域蛋白3（recombinant NLR family，pyrin domain containing protein 3，NLRP3）-IL-1β信號通路以及Toll樣受體4（Tolllike receptor 4，TLR4）-核因子κB（nuclear factorkappa B，NF-κB）-Caspase-1信號通路，參與炎癥反應，使患者體內炎性因子累積，加重腎臟損傷［21-23］，甚至可能導致腎臟衰竭。有氧跑臺訓練可以降低HUA患者體內UA水平，抑制Caspase-1、IL-1β蛋白的表達，減輕腎臟炎癥反應［23-25］。③GLUT-9轉運蛋白主要存在于近曲小管的頂端和基底外側膜上，是維持體內尿酸穩態主要的調節因子［15，26-27］，人體內UA清除與GLUT-9特定轉運蛋白密切相關。有氧跑臺運動訓練可以降低GLUT-9轉運蛋白表達，促進患者體內尿酸重吸收，降低患者腎臟炎癥水平，從而改善腎臟功能。這提示，有氧跑臺運動訓練改善HUA模型大鼠腎臟功能的具體機制可能與抑制GLUT-9蛋白表達有關。這與LIU等［28-29］研究結果相似。

4 小 結

有氧跑臺運動可以降低OAPS誘導的高尿酸血癥模型大鼠UA水平，減輕腎臟炎性反應，改善腎臟功能。但本研究仍存在一些不足之處，如未就有氧跑臺運動訓練抑制GLUT-9表達的具體機制進行探討；未就GLUT-9與其他可能影響尿酸排泄因素（如有機陰離子轉運蛋白等）的協同作用進行深入探討。