針刀對膝骨關節炎兔股直肌組織硬度和纖維化的影響

宮玉榕 林巧璇 劉 晶 郭澤興 盧莉銘 修忠標

1.福建中醫藥大學附屬人民醫院超聲醫學科，福建福州 350004；2.福建中醫藥大學附屬第三人民醫院骨傷科，福建福州 350122；3.福建中醫藥大學附屬人民醫院骨傷一科，福建福州 350004；4.福建中醫藥大學中醫學院，福建福州 350122

膝骨關節炎（knee osteoarthritis，KOA）是導致中老年患者膝痛和下肢功能障礙的常見病。膝關節動態力平衡失調可造成骨骼肌慢性損傷，引起力學性能下降，繼而加重筋骨失衡，導致持續軟骨面異常機械應力，加劇軟骨退變，這是KOA 發病重要機制之一[1]。骨骼肌慢性損傷修復過程會形成纖維化，嚴重影響骨骼肌功能[2]。本團隊前期研究顯示針刀松解股四頭肌常見經筋病灶點可調整下肢力線，延緩軟骨退變[3]；并通過實時組織彈性成像發現KOA 兔股直肌彈性應變率比值增高[4]。那么，針刀治療KOA 的作用機制是否與調節股直肌組織硬度和改善其纖維化相關，目前鮮有相關報道。因此，本研究探討從股直肌組織硬度和纖維化角度探討針刀治療KOA 的作用機制，為針刀治療KOA 的力學效應提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 動物與分組

選取24 只6 月齡普通級健康雄性新西蘭兔，體重為（2.2±0.3）kg。實驗動物的購買和飼養均由許可證號為SYXK（閩）2019-0007 的福建中醫藥大學實驗動物中心完成。參照隨機數字表法，將實驗兔分為3 組，分別是空白組、模型組、針刀組，每組各8 只。本研究經福建中醫藥大學實驗動物倫理委員會批準（批號：FJTCMIACUC），整個實驗過程均符合有關動物的使用及倫理學規定[5]。

1.2 主要試劑與儀器

Masson 染色試劑盒、4%多聚甲醛（G1340、P1110，北京索萊寶）；戊巴比妥鈉（P1110，德國Sigma）；戊二醛（F-A17876，美 國AlaAesar）；10%EDTA（GL1794，北京百奧萊博）；一次性使用無菌針刀（202007006，江西老宗醫）；全數字化彩色超聲波診斷儀（日本日立HI VISION Avius L）；光學顯微鏡（Motic BA210，深圳博視達光學）；自動脫水機（KL-T1，湖北康龍電子）；組織包埋機（BMJ-A，常州中威電子）；石蠟切片機（RM2235，德國Leica）；高分子石膏（AX002，陜西安信）。

1.3 模型制備

采用本團隊前期研究的改良Videman 法[6]制備兔左膝KOA 模型。固定6 周后，模型評價方法采用Lequesne 膝關節評估法[7]，具體包括疼痛、步態、活動度、腫脹情況4 個方面，當Lequesne MG 評分≥4 分，判定為兔左膝KOA 模型制備成功。

1.4 干預措施

空白組和模型組采取同樣的抓取和固定，但不予針刀治療。針刀組治療點為左后肢的“鶴頂次”“髕外上” “髕內上”，在施術部位定點、備皮消毒后，使用0.4 mm×40 mm 一次性無菌針刀進行松解。每7 天干預1 次，干預4 次。

1.5 觀察指標和檢測方法

1.5.1 Masoon 染色觀察股直肌組織形態、膠原纖維含量及膠原容積分數改變。腹腔注射3%戊巴比妥鈉溶液（1 ml/kg）麻醉后耳緣靜脈空氣栓塞處死，取左膝髕上1～3 cm 股直肌，4%多聚甲醛中固定24 h 后常規脫水，包埋，切片，制片。采用Masoon 染色試劑盒對標本行常規染色，脫水，透明，封片。鏡下觀察、攝片，計算膠原容積分數（軟件Image J，膠原容積分數=統一視野中膠原面積/所測視野面積）。

1.5.2 實時組織彈性成像檢測股直肌彈性應變率比值評估股直肌組織硬度改變。麻醉后行左膝關節超聲檢測。使用日立彩超HI VISION Avius L 儀器，選取彈性成像模式，運用5～15 MHz 高頻線陣探頭于髕上2 cm股直肌正上方的長軸進行彈性成像。采用超聲彈性成像分析軟件計算股直肌的彈性應變率比值（彈性應變率比值=感興趣點彈性應變值/皮下組織彈性應變值），反復測量3 次。彈性成像圖以紅色到藍色表示組織從“軟”到“硬”。

1.6 統計學方法

采用SPSS 20.0 軟件進行數據分析，數據以均數±標準差（±s）表示，比較使用兩獨立樣本t 檢驗。以P ＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 針刀對KOA 兔股直肌彈性超聲特征影響

空白組股直肌彈性成像呈綠色為主夾雜少許紅色的低彈性圖；模型組股直肌彈性成像呈藍色為主的高彈性圖；針刀組股直肌彈性成像呈藍綠相間的中彈性圖。與空白組比較，模型組股直肌彈性應變率比值升高（P ＜0.05）；與模型組比較，針刀組股直肌彈性應變率比值下降（P ＜0.05）。見圖1。

圖1 各組兔股直肌彈性超聲成像結果比較

2.2 針刀對KOA 兔股直肌Masson 染色結果影響

空白組骨骼肌肌纖維均勻紅染，排列整齊，無明顯藍色膠原纖維生成；模型組可見明顯骨骼肌肌纖維破壞，肌纖維間隔增大，大量藍染的膠原纖維沉積在骨骼肌肌纖維破壞處、新生肌細胞、肌間膜處，肌纖維化形成；針刀組可見散在骨骼肌肌纖維破壞，肌纖維間隔較模型組減小，骨骼肌肌纖維破壞處、新生肌細胞、肌間膜處有少量藍染的膠原纖維沉積，纖維化程度減小。模型組股直肌膠原容積分數較空白組增加（P ＜0.05）；針刀組股直肌膠原容積分數較模型組減小（P ＜0.05）。見圖1。

圖2 各組兔股直肌Masson 染色結果比較（400×）

3 討論

中醫學認為，膝為筋之府，“筋束骨，骨張筋”，“骨正筋柔”調和狀態可維持膝關節正常生理功能[9]。倘若筋骨平衡失調出現“筋出槽、骨錯縫”病理狀態，骨骼肌遭受累積性應力導致氣血運行障礙，代謝產物堆積，形成粘連、瘢痕，產生疼痛和下肢功能障礙而發KOA[10]。針刀為中醫原創技術，擅長松解粘連、瘢痕，疏通堵塞，調節病變軟組織力學性能[11]，改善軟骨力學結構[12]和免疫微環境[13]，延緩軟骨退變[14]，從而有效改善KOA 疼痛和下肢功能障礙[15]。然而，其對骨骼肌慢性損傷修復的作用機制尚不明確。慢性骨骼肌損傷形成的粘連、瘢痕特征為組織硬度增加[16]，病理改變與骨骼肌纖維化相關[17]。實時組織彈性成像也能檢測病灶區彈性變化評價治療前后軟組織硬度情況[18]，彈性應變率比值與組織硬度呈正相關，值越大說明組織硬度越高[19]。Masson 染色可以很好地反映骨骼肌纖維化程度[20]。因此，本研究憑借Masson 染色和超聲彈性成像技術從股直肌組織硬度和纖維化角度探討針刀治療KOA 的作用機制。

本研究中，模型組股直肌彈性成像呈藍色為主的高彈性圖，模型組股直肌彈性應變率比值較空白組明顯升高；且模型組股直肌可見明顯骨骼肌細胞破壞，大量藍染的膠原纖維填充在骨骼肌細胞破壞處，肌膠原纖維和膠原容積分數較空白組增加。提示改良Videman 法固定兔左后肢6 周可導致股直肌組織硬度增加和纖維化改變。相關研究表明持續異常機械應力可以介導骨骼肌細胞凋亡[21]，機體在自我修復過程中大量膠原纖維等細胞外基質沉積，導致組織硬度增加和嚴重骨骼肌纖維化[22]，與研究結果具有一致性。而針刀干預后股直肌彈性成像呈藍綠相間的中彈性圖針刀組股直肌彈性應變率比值、膠原纖維含量和膠原容積分數較模型組下降，提示針刀可以改善KOA 兔股直肌組織組織硬度和纖維化程度。既往研究表明，針刀減少骨骼肌細胞凋亡[23]，促進骨骼肌病理形態和功能修復[24-25]，這與本研究結果一致。

綜上，針刀可以改善KOA 兔股直肌組織硬度，促進股直肌慢性損傷纖維化的修復，這可能是針刀治療KOA 的力學效應機制之一。但本研究樣本量較小，而且本研究超聲設備無剪切波彈性成像功能，未能通過具體的彈性模型值對股直肌組織硬度進行定量評估，有待進一步大樣本量實驗和臨床研究證實針刀對骨骼肌慢性損傷修復作用。