基于微流控芯片裝置的臨床患者循環(huán)腫瘤細胞分選及分析

姜佳寧 王 琪 王若雨 高金琦 陳雯婷 王 剛

大連大學附屬中山醫(yī)院腫瘤科，遼寧大連 116001

惡性腫瘤的發(fā)病率、死亡率逐年呈穩(wěn)定上漲趨勢，發(fā)病年齡則出現(xiàn)年輕化趨勢[1]。隨著腫瘤發(fā)病機制探討、新藥研發(fā)、診療手段的不斷規(guī)范化、精準化，患者的診斷率、治療有效率都有了明顯的提升。然而，惡性腫瘤細胞通常具備高侵襲能力，一旦出現(xiàn)腫瘤轉(zhuǎn)移，將大大提高患者的死亡風險[2]。雖現(xiàn)有技術已明顯提高了腫瘤患者的檢出率，但對于精準診療、評估預后、評價療效等方面存在很多不足之處，仍有很大一部分患者就診時已處于晚期，失去最佳治療機會。提高惡性腫瘤患者的早期檢出率是解決問題的關鍵。隨著循環(huán)腫瘤細胞（circulating tumor cells，CTC）的出現(xiàn)及不斷深入研究，CTC 分選作為一種“液態(tài)病理活檢”技術，可協(xié)助臨床診斷明確、轉(zhuǎn)移評估、預后判斷、療效評價及精準個體化醫(yī)療的指導[3-4]。美國強生公司開發(fā)的CellSearch System 是唯一被食品藥品監(jiān)督管理局批準，用于臨床乳腺癌、肺腺癌、結(jié)直腸癌、前列腺癌患者的CTC檢測。但該裝置因檢測成本高、操作復雜、體積笨重等不足，尚未廣泛應用于臨床患者CTC檢測。因此，如何實現(xiàn)臨床CTC 快速、方便、準確的檢測一直是研究的熱點。微流控芯片技術具備微型化、自動化、集成化和便攜化等優(yōu)勢，彌補傳統(tǒng)檢測方法的不足，在生物技術、醫(yī)學、物理研究等方面均有所應用[5]。因此，利用微流控芯片的優(yōu)勢，構(gòu)建集成化的CTC 分選裝置，克服了CellSearch System的不足，具備成本低、無創(chuàng)、簡單、可重復、順應性好等優(yōu)勢，并可獲得高達90%以上的檢測率，更適合于臨床患者CTC的檢測[6]。本研究將應用該檢測裝置對55 例臨床腫瘤患者外周血標本CTC 分選，分析CTC 分選結(jié)果與患者臨床病理特征，包括發(fā)病年齡、性別、腫瘤分化程度、分期、類別、腫瘤轉(zhuǎn)移及療效評價的相關性。以期進一步實現(xiàn)該裝置的臨床普及應用，為提高腫瘤患者的診斷及治療提供更好的方法。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 儀器 倒置熒光顯微鏡、光刻機、甩膠機、等離子去膠機、超凈工作臺、二氧化碳水套式培養(yǎng)箱、LS100CO2 激光雕刻機、OB1 pressure controller、熱壓機、低溫高速離心機。

1.1.2 試劑 芯片制備試劑：PDMS、固化劑、CD45 磁珠、紅細胞裂解液。免疫親和反應試劑：鼠尾膠原蛋白、EpCAM 抗體、CD45 抗體、panCytokerin 抗體。

1.1.3 研究對象 本研究納入2017 年1 月至2018 年12 月在大連大學附屬中山醫(yī)院確診的惡性腫瘤患者共55 例，每例患者抽取外周靜脈血4 ml。其中男25 例，女30 例；年齡42～82歲，平均（61.02 ±19.14）歲。納入標準：初治經(jīng)病理證實的惡性腫瘤。排除標準：①存在肝腎功能異常及心、腦、精神系統(tǒng)等疾病等。②臨床資料不完整。本項研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會同意批準（批號：2017071）。參與的患者或家屬均知情同意，并簽署知情同意書。

1.2 研究方法

1.2.1 基于微流控芯片的CTC 分選裝置構(gòu)建 本研究利用微流控芯片技術平臺，構(gòu)建了集成化的CTC 分選平臺。該平臺由DLD 芯片、磁場負性純化芯片及鼠尾膠原蛋白捕獲組成。DLD 芯片的設計是依據(jù)CTC的物理學特性，其尺寸為15～20 μm,明顯大于紅細胞、血小板及95%以上白細胞。磁場負性純化平臺是依據(jù)白細胞表面特異性表達CD45 抗體，因此經(jīng)DLD分選后的樣本經(jīng)過CD45 磁珠充分作用后，在磁場負性分離作用下將白細胞進一步去除。最后，CTC 與極少量的白細胞通過正性分選免疫親和反應被捕獲，CTC 表達為EPCAM+/CK+/CD45-，白細胞表達為EPCAM-/CK-/CD45+，整體示意圖見圖1[6]。

1.2.2 標本采集 應用EDTA 抗凝管留取患者初治前、治療后的外周靜脈血標本各4 ml，室溫保存，6 h 內(nèi)完成檢測。

1.2.3 臨床腫瘤患者外周血CTC 分選 應用既往設計的微流控芯片裝置分選CTC，記錄每例患者外周血的CTC 情況，分析檢測結(jié)果與患者發(fā)病年齡、性別、腫瘤診斷、臨床分期、分化程度等臨床資料的相關性。

1.3 觀察指標

分析患者CTC 分選結(jié)果與患者性別、年齡、診斷、分期、癌腫不同及腫瘤轉(zhuǎn)移的相關性。同時，對于接受抗腫瘤治療的患者，觀察治療前后CTC 數(shù)目的變化與臨床影像學（CT、彩超、核磁等）評效的一致性。

1.4 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 22.0 軟件進行統(tǒng)計學分析。計數(shù)資料采用百分率表示，組間比較采用χ2檢驗；療效評價分析采用Kappa 一致性檢驗。其中Kappa≥0.75 為兩者一致性較好；0.75＞Kappa≥0.4 為兩者一致性一般；Kappa＜0.4 為兩者一致性較差。以P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 55 例患者一般臨床病理特征

55 例惡性腫瘤患者中CTC 陽性例數(shù)為29 例，檢出率為52.73%，共檢出178個CTC。檢出率與腫瘤分化及腫瘤TNM 分期有關（P ＜0.05），與發(fā)病年齡、性別及不同腫瘤類別無關（P ＞0.05）。見表1。

表1 55 例患者一般臨床病理特征及基線CTC 計數(shù)分析

2.2 CTC檢測結(jié)果與腫瘤轉(zhuǎn)移的關系

上述55 例患者中，29 例檢測結(jié)果為陽性，其中28 例臨床已證實有明確的轉(zhuǎn)移灶，即CTC檢出率為陽性的患者中，96.6%的患者存在轉(zhuǎn)移。對于檢測結(jié)果為陰性的26 例患者中，18 例存在轉(zhuǎn)移。檢出率與腫瘤轉(zhuǎn)移情況相關（χ2=5.613，P ＜0.05）。

2.3 CTC檢測數(shù)目變化與影像學檢查結(jié)果評估療效的關系

在55 例患者中，剔除去首診后拒絕行抗腫瘤治療的患者及早期未檢測到CTC 后續(xù)復查仍檢測結(jié)果為陰性的患者，共39 例患者納入進一步分析。于治療（化療、放療、分子靶向治療、內(nèi)分泌治療）前后分別檢測外周血中CTC 數(shù)目，同時行胸腹部CT 等相關檢查，根據(jù)RECIEST 評價標準進行評效。在39 例患者中，26 例患者治療后復查CTC 數(shù)目上升，經(jīng)臨床檢查：血清腫瘤標志物及影像學，包括CT、MRI、全身骨顯象、超聲等。結(jié)果發(fā)現(xiàn)其中8 例患者病情復發(fā)，16 例患者病情進展，療效評價為進展，2 例患者病情穩(wěn)定，療效評價穩(wěn)定。對于CTC檢測結(jié)果不變或下降的13 例患者，其中9 例患者為治療后復查未見腫瘤復發(fā)轉(zhuǎn)移征象。4 例患者為行下周期化療入院，臨床療效評價部分緩解或穩(wěn)定。通過Kappa 一致性檢驗分析，結(jié)果提示CTC檢測情況與RECIEST 標準評價效果存在良好的一致性（Kappa=0.889，P ＜0.001）。見表2。

表2 CTC 變化與影像療效評價關系統(tǒng)計表

3 討論

惡性腫瘤通常分化程度差、惡性程度高，早期易發(fā)生轉(zhuǎn)移，一旦出現(xiàn)轉(zhuǎn)移，患者預后極差，生存期嚴重縮短，死亡率大幅度提高[7]。現(xiàn)有的腫瘤檢查技術手段對明確診斷、判斷預后及指導治療存在一定的局限，主要有影像學、血清腫瘤標志物、組織病理學和細胞學檢查等。影像學檢查雖能直觀地評價腫瘤的大小和侵及范圍，但靈敏度低，對微小病灶檢出率低。血清腫瘤標志物檢測可用于輔助診斷、監(jiān)測腫瘤進展和復發(fā)，但是目前尚缺少特異的腫瘤標志物，假陽性率和假陰性率較高。病理學診斷是腫瘤診斷的“金標準”，但通過手術或穿刺方法獲得活檢樣本的方法對患者的創(chuàng)傷較大。另外，取材受限常導致無法實現(xiàn)對腫瘤實時動態(tài)的監(jiān)測。CTC 與腫瘤轉(zhuǎn)移密切相關，CTC 分選有助于預測及明確腫瘤轉(zhuǎn)移，并反映腫瘤特征，為腫瘤診治提供依據(jù)，也可作為靶向治療的靶標指導治療方案的制訂[8]。且采集外周血具備創(chuàng)傷小、順應性好、操作方便及可重復等優(yōu)勢，有望克服臨床腫瘤診療的難題。

現(xiàn)有的CTC 分選原理主要依據(jù)兩方面，基于物理學特性[9-11]及生物學特性進行分選[12-16]。本研究構(gòu)建的基于微流控芯片的集成化的CTC 分選裝置，融合了二者優(yōu)勢，克服了各自的不足。首先，基于CTC的尺寸遠大于正常外周血細胞（紅細胞、血小板及大部分白細胞）的物理學特性，構(gòu)建了CTC 初步快速的分選芯片—DLD 芯片，在1 ml/min的通量下實現(xiàn)CTC 初步快速的分選，通過該芯片可使95%以上的白細胞、全部紅細胞、血小板被去除。隨后，依據(jù)白細胞表面特異性表達CD45，構(gòu)建自動化的磁性負性純化裝置，進一步去除殘余白細胞90%以上。最后，利用CTC的生物學特性進行免疫親和鑒定反應，最終CTC 表達EPCAM+/CK+/CD45-，與白細胞表達EPCAM-/CK-/CD45+被分離鑒定。本研究前期研究還通過對標準細胞株的檢測實現(xiàn)90%以上檢測率，并將對臨床患者CTC 分選結(jié)果與CellSearch System 對比，發(fā)現(xiàn)該裝置的分選效率優(yōu)于CellSearch System，且在檢測成本、方便性、所需樣本量、檢測時間等方面均具備明顯優(yōu)勢[6]。

為實現(xiàn)該裝置的臨床應用，本研究中應用該裝置檢測了55 例臨床初治的惡性腫瘤患者CTC，CTC 陽性為29 例，檢出率為52.73%，通過χ2檢驗，發(fā)現(xiàn)CTC檢出率與腫瘤分化程度、腫瘤分期及臨床轉(zhuǎn)移相關（P ＜0.05），而與性別、年齡及癌種無關（P ＞0.05）。這與目前大多數(shù)臨床CTC檢測結(jié)果分析一致[17-21]。此外，本研究對接受治療的39 例患者進行了治療后的CTC 復查，為臨床療效評價，予以完善胸腹部CT、乳腺、淺表淋巴結(jié)彩超等檢查，探討治療前后相同患者CTC檢測水平變化與影像學評效的關系，結(jié)果發(fā)現(xiàn)對于CTC 數(shù)目升高26 例患者中，24 例出現(xiàn)了病情進展，另2 例影像學評效縮小或穩(wěn)定，腫瘤標志物出現(xiàn)輕度升高，不除外處于腫瘤進展的早期，臨床嚴密觀察。而對于CTC 數(shù)目下降或不變的13 例患者，療效評價均為SD 或PR，Kappa檢驗提示二者的結(jié)果一致（P ＞0.05）。因此，本研究提出利用CTC的動態(tài)檢測可協(xié)助臨床療效的評價，指導治療，與現(xiàn)有臨床報導相符[22-26]。

因此，本研究提出CTC檢測有助于協(xié)助臨床評估腫瘤分化程度、預測分期、明確轉(zhuǎn)移，并起到療效評價、指導治療的作用。而本研究設計的基于微流控芯片的CTC檢測裝置具備檢測率高、檢測成本低、檢測方便等優(yōu)勢，有望實現(xiàn)CTC的臨床普及應用，協(xié)助提高臨床患者診治率，提高患者生存質(zhì)量、延長生存期。