丁酸梭菌對主要商業飼用益生菌抑制作用的研究

王紹斌，張海鵬，高映紅，王 配，肖明霞，王乙茹，PHOUTHAPANE Vanhnaseng，程志斌*

（1.云南農業大學，昆明 650201；2.玉溪市紅塔區動物衛生監督所，云南 玉溪 653100；3.昆明云嶺廣大種禽飼料有限公司，昆明 650200；4.達州職業技術學院，四川 達州 635001；5.老撾農林部畜牧與水產局，老撾 萬象 6644）

自2020年7月1日我國飼料工業全面禁用以促生長為目的的藥物飼料添加劑以來，單一及復合飼用益生菌“替抗”的應用效果與評估技術受到行業高度關注[1-3]。近年來，具有調控腸道菌群功效的飼用益生菌丁酸梭菌（Clostridium butyricum）成為行業關注的熱點[4-6]。大量動物試驗結果顯示[7-13]，飼糧單一添加丁酸梭菌對腸道多種有害菌具有顯著抑制作用，有助于畜禽生長性能的改善。據此，研發人員為進一步提升飼喂單一丁酸梭菌的應用效果，初步開展了丁酸梭菌與其他主要商業益生菌的復合益生菌產品研發。現有研究顯示：僅有3篇動物飼養試驗報道丁酸梭菌與枯草芽孢桿菌[14-15]、地衣芽孢桿菌[16]的復合益生菌的飼喂效果優于單一飼用丁酸梭菌；相反，更多的飼養試驗顯示，與單一飼用丁酸梭菌比，丁酸梭菌與枯草芽孢桿菌[17-18]、地衣芽孢桿菌[19]、凝結芽孢桿菌[20]或釀酒酵母[21]的復合益生菌，未能進一步改善動物生產性能。以上矛盾的飼養試驗結果提示，排除試驗動物、養殖條件、試驗設計等因素的干擾，丁酸梭菌與其他商業益生菌可能存在拮抗效應。

鑒于動物飼養試驗易受試驗動物品種、日齡、養殖環境衛生條件、試驗因素及處理組設計等干擾[3,22-23]，建立客觀、標準的體外丁酸梭菌與其他商業益生菌復配效果的評估技術，有助于高效研發丁酸梭菌的復合益生菌產品。據此，本研究創新采用體外牛津杯抑菌試驗法，探究丁酸梭菌對其他商業飼用益生菌可能的抑制作用，以便篩選出丁酸梭菌與其他商業飼用益生菌的復配方案，為穩定動物飼養試驗結果、保障養殖應用效果提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 益生菌

丁酸梭菌，從云南西雙版納茶花雞養殖場分離，經鑒定命名為丁酸梭菌YNAU 5738，用于本次抑菌性能試驗評估。

本試驗6個指示菌，包括凝結芽孢桿菌（Bacillus coagulansATCC 7050）、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilisATCC PTA-6737）、地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformisbio-58806）、屎腸球菌（Enterococcus faeciumbio-67122）、糞腸球菌（Enterococcus faecalisBNCC192631）、 產 朊 假 絲 酵 母（Candida utiliBNCC336517），購買自北納創聯生物科技有限公司。

1.2 牛津杯抑菌試驗

1.2.1 丁酸梭菌及指示菌的培養

（1）RCM 培養基：酵母膏3.0 g、牛肉膏10.0 g、胰蛋白胨10.0 g、葡萄糖5.0 g、可溶性淀粉1.0 g、NaCl 5.0 g、三水合乙酸鈉3.0 g、半胱氨酸鹽酸鹽0.5 g、蒸餾水1 000 mL。RCM 培養基厭氧培養丁酸梭菌24 h[24]。

（2）LB培養基：酵母膏5.0 g、胰蛋白胨10.0 g、NaCl 10.0 g、蒸餾水1 000 mL。LB培養基有氧培養枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌24 h[22]。

（3）MRS培養基：酵母膏10.0 g、蛋白胨20.0 g、NaCl 2.5 g、葡萄糖20.0 g、番茄汁50 mL、磷酸氫二鉀2.0 g、硫酸鎂1.0 g、蒸餾水1 000 mL。MRS培養基有氧培養屎腸球菌、糞腸球菌、產朊假絲酵母菌24 h[22]。

（4）凝結芽孢桿菌采用改良MRS培養基，參考柳成東等[25]的方法。

1.2.2 指示菌涂布平板制備

指示菌涂布平板采用MRS培養基，121 ℃滅菌30 min后冷卻，至50 ℃左右倒入培養皿15～20 mL。凝固后待水分干燥即可涂布。

1.2.3 指示菌液稀釋涂布

將以上培養24 h的6個指示菌的菌液，每個吸取800 μL，轉入裝有7.2 mL 無菌水的EP 管中，進行梯度稀釋至10-3，涂布。每個指示菌涂3 個培養皿（3次平行測定）。

1.2.4 牛津杯抑菌測定

為了評估與比較丁酸梭菌對6個指示菌的抑菌作用及效果，每個指示菌吸取200 μL涂布1個培養皿，并在每個培養皿中放置1個牛津杯，在牛津杯加入200 μL 的丁酸梭菌菌液，隨后置于恒溫箱37.5 ℃培養。除凝結芽孢桿菌培養48 h 外，其余5 個指示菌均培養24 h。用游標卡尺測量抑菌圈直徑（diameter of inhibition zone，DIZ）的最大值與最小值，以二者的平均值確定抑菌圈直徑。

1.2.5 抑菌作用判定方法

當前丁酸梭菌抑菌作用尚無統一的判定標準，依據本次抑菌試驗所測的抑菌直徑數據，制定以下抑菌作用判定標準：不敏感，DIZ=7.8 mm；低敏感，7.8 mm＜DIZ≤10.0 mm；中敏感，10.0 mm＜DIZ≤12.0 mm；高敏感，DIZ＞12.0 mm。

1.3 統計方法

抑菌圈直徑數據采用“平均值±標準差”表示。為了區分丁酸梭菌對不同指示菌的抑菌效果，對6 個指示菌之間的抑菌圈直徑數據進行單因素方差分析和LSD 多重比較，P＜0.05 表示統計差異顯著。依據顯著性差異區分4個區間的抑菌作用判定標準。

2 結果與分析

試驗結果表明，丁酸梭菌對凝結芽孢桿菌的抑制作用達到“高敏感”（DIZ＞12.0 mm），對地衣芽孢桿菌的抑制作用為“中敏感”（10.0 mm＜DIZ≤12.0 mm），對枯草芽孢桿菌的抑制作用為“低敏感”（7.8 mm＜DIZ≤10.0 mm），對屎腸球菌、糞腸球菌、產朊假絲酵母的抑制作用均判定為“不敏感”（DIZ=7.8 mm）。見表1和圖1。

表1 丁酸梭菌對6個商業飼用益生菌的抑菌圈直徑（DIZ） mm

圖1 丁酸梭菌對6個商業飼用益生菌的抑制作用

3 討 論

我國農業農村部《飼料添加劑品種目錄（2013）》列出了34 個在畜禽、水產飼料中允許應用的飼用益生菌[22,26]。除丁酸梭菌外，當前我國飼料工業中應用與推廣較多的商業飼用益生菌包括凝結芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌、酵母菌、糞腸球菌及屎腸球菌[22]。目前，單一飼用丁酸梭菌改善畜禽、水產動物生產性能的研究已有大量報道[27-30]，但關于丁酸梭菌和其他商業益生菌復合飼用的研究較少，且飼養試驗結果并不一致[14-21]。為了提高復合益生菌的研發效率及飼用效果的穩定性，本研究從體外抑菌試驗著手，重點分析丁酸梭菌與其他6 個商業飼用益生菌之間可能存在的拮抗作用。

3.1 丁酸梭菌與凝結芽孢桿菌具有拮抗效應

本研究結果顯示，丁酸梭菌對凝結芽孢桿菌的抑制作用達到“高敏感”，表明丁酸梭菌與凝結芽孢桿菌之間具有拮抗效應。目前，僅有的1篇文獻對虹鱒魚飼養試驗的研究結果顯示，單一飼喂7.35×106cfu·g-1（全價配合飼料）丁酸梭菌顯著改善了虹鱒魚增重和飼料轉化率；然而，與單一丁酸梭菌組比，添加丁酸梭菌與凝結芽孢桿菌的復合益生菌組（7.35×106cfu·g-1丁酸梭菌+2.40×106cfu·g-1凝結芽孢桿菌）反而使虹鱒魚增重和飼料轉化率略有降低，差異不顯著[20]。由此可見，本研究體外試驗結果驗證了樊英等[20]的試驗結果。此外，盡管樊英等[20]檢測了虹鱒魚腸道菌群“門”水平的數據，但該結果未能從“屬”和“種”的水平驗證生長性能的這一變化。綜上分析，丁酸梭菌與凝結芽孢桿菌之間具有拮抗效應，這有待于更多的飼養試驗與腸道菌群分析數據支撐。

3.2 丁酸梭菌與地衣芽孢桿菌具有拮抗效應

本研究結果顯示，丁酸梭菌對地衣芽孢桿菌的抑制作用為“中敏感”，表明丁酸梭菌與地衣芽孢桿菌之間具有拮抗效應。袁慧坤等[16]研究結果顯示，單一飼喂5.0×105cfu·g-1丁酸梭菌顯著改善了北京鴨生長性能；然而，與單一丁酸梭菌組比，添加丁酸梭菌與地衣芽孢桿菌的復合益生菌組（5.0×105cfu·g-1丁酸梭菌+1.0×106cfu·g-1地衣芽孢桿菌）肉鴨的平均日增重、平均日采食量、料重比等生長性能指標差異均不顯著。尹會方等[19]在斷奶仔豬上的研究結果顯示，與丁酸梭菌組（4.0×105cfu·g-1丁酸梭菌）比，添加丁酸梭菌與地衣芽孢桿菌的復合益生菌組（4.0×105cfu·g-1丁酸梭菌+4.0×105cfu·g-1地衣芽孢桿菌）仔豬平均日增重顯著增加，但平均日采食量和料重比差異均不顯著。上述僅有的2篇飼養試驗報道與本研究丁酸梭菌與地衣芽孢桿菌具有拮抗效應的結果基本相符。

3.3 丁酸梭菌與枯草芽孢桿菌可能具有拮抗效應

本研究結果顯示，丁酸梭菌對枯草芽孢桿菌的抑制作用為“低敏感”，表明丁酸梭菌與地衣芽孢桿菌之間可能具有拮抗效應。農斯偉等[17]采用廣西黎村黃雞研究顯示，與丁酸梭菌組（2.9×105cfu·g-1丁酸梭菌）比，添加丁酸梭菌與枯草芽孢桿菌的復合益生菌組（2.0×105cfu·g-1丁酸梭菌+5.5×105cfu·g-1枯草芽孢桿菌）黃雞的平均日增重、平均日采食量、料重比和死淘率等生長性能指標均差異不顯著。分析腸道菌群“屬”水平數據發現：代表腸道有益菌的乳桿菌屬細菌數量指標，復合益生菌組較單一丁酸梭菌組顯著下降；代表腸道有害菌的另枝菌屬細菌數量指標，復合益生菌組較單一丁酸梭菌組顯著上升。于潔等[18]在揚州公鵝上的研究同樣顯示，與丁酸梭菌組（3.0×106cfu·g-1丁酸梭菌）比，添加丁酸梭菌與枯草芽孢桿菌的復合益生菌組（3.0×106cfu·g-1丁酸梭菌+2.0×107cfu·g-1枯草芽孢桿菌）鵝的增重、采食量和料重比均差異不顯著。由此可見，本研究體外試驗結果驗證了以上2個飼養試驗的結果。

另外，孫玲玲等[14]研究顯示，與單一丁酸梭菌組比，添加丁酸梭菌與枯草芽孢桿菌的復合益生菌組的五龍鵝平均日增重顯著增加，但平均日采食量和料重比差異不顯著。何菊等[15]的研究結果顯示，與單一丁酸梭菌組比，添加丁酸梭菌與枯草芽孢桿菌的復合益生菌組肉雞平均日增重顯著增加，料重比差異也不顯著。然而，何菊等[15]分析肉雞腸道菌群數據卻顯示，與單一丁酸梭菌組比，復合益生菌組盲腸食糜有害菌大腸桿菌和沙門氏菌數量顯著增加，有益菌乳酸桿菌和雙歧桿菌數量顯著降低。這一結果顯然與以上報道的生長性能數據矛盾。

綜合以上分析，本研究認為丁酸梭菌與枯草芽孢桿菌可能具有拮抗效應。

3.4 丁酸梭菌與酵母菌、屎腸球菌、糞腸球菌之間無拮抗效應

本研究結果顯示，丁酸梭菌對酵母菌的抑制作用為“不敏感”，表明丁酸梭菌與酵母菌之間無拮抗效應。目前，僅有的一篇關于肉雞飼養試驗的研究結果顯示[21]：單一飼喂5.0×106cfu·g-1丁酸梭菌顯著改善了肉雞增重和飼料轉化率；與單一丁酸梭菌組比，添加丁酸梭菌與釀酒酵母的復合益生菌組（2.5×106cfu·g-1丁酸梭菌+2.5×106cfu·g-1釀酒酵母）肉雞各項生長性能指標未進一步改善。進一步分析肉雞糞便菌群顯示[21]，與單一丁酸梭菌組比，復合益生菌組糞便乳酸桿菌數量顯著上升。這一結果提示丁酸梭菌對酵母菌無拮抗效應，可作為復合益生菌研究應用。

此外，本試驗首次研究了丁酸梭菌對屎腸球菌、糞腸球菌的抑制作用，結果顯示丁酸梭菌對屎腸球菌、糞腸球菌均無抑制作用，這表明丁酸梭菌與屎腸球菌、糞腸球菌之間無拮抗效應。誠然，這有待于動物飼養試驗的進一步驗證。

4 結 論

本研究采用體外牛津杯法評估了丁酸梭菌對6 個主要商業飼用益生菌的抑制作用，結果顯示丁酸梭菌對凝結芽孢桿菌的抑制作用達到“高敏感”，對地衣芽孢桿菌的抑制作用為“中敏感”，對枯草芽孢桿菌的抑制作用為“低敏感”，對產朊假絲酵母、屎腸球菌、糞腸球菌的抑制作用均判定“不敏感”。以上結果提示，牛津杯法適合評估丁酸梭菌與其他商業益生菌之間存在的可能拮抗效應，這對復合益生菌的研發、篩選與應用具有科學指導意義。