一例罕見AB類孟買血型的鑒定分析

陳碧樂，洪俊英，劉夢召，謝作聽

溫州醫科大學附屬第一醫院輸血科，浙江 溫州 325015

類孟買血型是H血型系統的一種稀有表型[1]，其主要特征為紅細胞上H抗原部分或完全缺失/轉化，紅細胞表面缺乏ABH抗原，而在唾液等分泌液中卻可以找到ABH血型物質[2]，血漿中常存在抗H抗體。近年來，國內外關于類孟買血型的報道逐漸增多，其中以A、B類孟買血型居多，而AB類孟買血型較少見[3-6]。本研究對一例由FUT1 等位基因堿基缺失導致H抗原不表達形成AB類孟買血型的家系進行血型血清學鑒定和基因突變分析，初步探討其分子生物學機制。

1 對象和方法

1.1 對象 先證者，女，35歲，漢族，體健，既往無輸血史，因健康體檢于2021年10月來溫州醫科大學附屬第一醫院體檢中心就診并申請血型鑒定，血型血清學檢測結果疑似其血型為類孟買型。參與本次調查的家系成員包括其母親、哥哥、姐姐及兩個女兒的血液進一步進行血型及基因檢驗。標本采集及實驗研究前嚴格履行知情同意及倫理論證流程。

1.2 試劑及儀器 IH-1000全自動血型鑒定儀（美國BIO-RAD公司）；專用離心機（臺灣貝索企業有限公司，型號2005-2）；OLYMPUSCX21普通光學顯微鏡（日本歐林巴斯公司）；微柱凝膠卡（瑞士DiaMed公司，批號5007267709）；單克隆抗A、抗B試劑（上海血液生物醫藥有限責任公司，批號20190915）；人ABO反定型紅細胞（北京金豪制藥股份有限公司，批號20201001024）；抗-H、抗-Lea、抗-Leb試劑（德國GmbH公司，批號分別為OHM142-2、OLeaM121-1、OLebM109-1）；不規則抗體篩選試劑（江蘇力博醫藥生物技術股份有限公司，批號202010020）；不規則抗體特異性鑒定譜細胞（匈牙利REAGENSKft公司，批號732021）；3%O型臍帶血洗滌紅細胞（本室自制）。

1.3 血型血清學實驗

1.3.1 血清學實驗：ABO血型正反定型，采用鹽水介質試管法和微柱凝膠抗人球蛋白法；紅細胞上弱A、B、H抗原檢測，采用4℃-吸收-56℃-放散法；唾液中可溶性A、B、H血型物質檢測，采用中和抑制試驗；Lea、Leb抗原檢測，采用鹽水介質試管法[7]。

1.3.2 紅細胞血型不規則抗體篩查與鑒定：采用鹽水介質試管法和微柱凝膠抗人球蛋白法，確定抗體免疫球蛋白類型和抗體特異性。若抗體特異性疑為IgM類抗H或抗HI抗體時，加做O型臍帶血洗滌紅細胞反應；若O型臍帶血洗滌紅細胞不凝集時判為抗HI抗體，否則判為抗H[8]。

1.3.3 DNA抽提和PCR擴增：用美國Invitrogen公司血液基因組DNA提取試劑盒，提取先證者及其家系成員外周血標本基因組DNA。采用PCR分別擴增ABO基因、FUTl基因和FUT2基因，引物序列見表1，擴增條件參照文獻報道[6]。

1.3.4 PCR產物直接測序：采用DNA瓊脂糖凝膠純化試劑盒（美國Invitrogen公司）純化ABO 基因、FUTl基因和FUT2 基因擴增的PCR產物，將純化PCR產物用作測序反應DNA模板，在ABI-3100Avant測序儀檢測分析。用Chromas2.33軟件閱讀圖譜，GeneRunnerversion3.05 軟件拼合、比對和分析測序結果，將測序結果與人類紅細胞血型基因數據庫基因序列進行比對。

表1 ABO、FUT1、FUT2 引物序列及參考基因序列號

2 結果

2.1 血型血清學實驗結果

2.1.1 ABO血型正反定型：先證者微柱凝膠法正反定型結果不符，鹽水介質試管法正反定型結果存疑（表現為反定型凝集強度異常）；其他家系成員兩種方法正反定型結果相符，見表2。

2.1.2 紅細胞上弱A、B、H抗原檢測：先證者紅細胞未檢測到H抗原，紅細胞放散液檢到A抗原（未檢到B抗原），見表2。

2.1.3 先證者紅細胞不規則抗體篩查和鑒定：經鹽水介質試管法和微柱凝膠抗人球蛋白法，證明存在IgM類抗HI抗體，見表2。

2.1.4 紅細胞Lea、Leb抗原檢測：先證者及其家系成員Lewis血型均為Lea（-）Leb（+），見表2。

2.2 唾液中可溶性血型物質A、B、H檢測結果 先證者唾液中檢到A、B、H血型物質，可判定先證者ABH血型物質為分泌型。其家系成員唾液中檢到的ABH血型物質與ABO正定型檢到的抗原一致，見表2。

2.3 ABO、FUT1 和FUT2 基因檢測結果

2.3.1 ABO基因直接測序結果：先證者ABO基因型為：ABO*A1.02/B.01，其ABO糖基轉移酶基因第6及7外顯子序列為：c.467C＞T、c.297A＞G、c.526C＞G、c.657C＞T、c.703G＞A、c.796C＞A、c.803G＞C和c.930G＞A，證實先證者血型為AB型。

表2 先證者及其家系成員的血型血清學結果

2.3.2 FUT1 和FUT2 基因測序結果：直接測序顯示先證者FUT1 基因有2 處雜合缺失突變，分別位于編碼區序列第551～第552位堿基AG雜合缺失突變（c.551-552delAG）和第880～第882位堿基TT雜合缺失突變（c.881-882delTT），因此推測同源染色體上的兩個等位基因H都各自發生了缺失突變；其母親、姐姐、大女兒和小女兒FUT1 基因均為c.881-882delTT雜合缺失突變，哥哥為c.551-552delAG雜合缺失突變，均為H/h基因型，能表達H抗原。先證者FUT2 基因測序結果存在c.357C＞T純合多態性。測序結果見圖1。

圖1 先證者FUT1 基因測序結果（A、B）及FUT2 基因測序結果（C）

3 討論

人類H血型物質的表達與H基因（FUT1）和Se基因（FUT2）密切相關，且與ABO基因、Lewis基因（FUT3）存在一定關聯。ABO 基因位于9號染色體，FUT1、FUT2和FUT3均位于19號染色體。FUT1編碼II型α-1，2-L-巖藻糖基轉移酶，可催化II型H前體物質合成紅細胞上的H物質；FUT2 編碼可催化分泌液中的I型H前體物質合成可溶性H物質，故FUT1 或（和）II型α-1，2-L-巖藻糖基轉移酶缺乏或突變時，會影響紅細胞H物質的表達，而FUT2 或（和）I型α-1，2-L-巖藻糖基轉移酶缺乏或突變時，會影響分泌液中H物質的表達。H抗原是A、B抗原形成的前體物質，當H抗原缺失或突變，可導致紅細胞上A、B抗原合成障礙，最終形成類孟買血型[6]。

類孟買血型是一種罕見的紅細胞表型，在中國人群中的比例總體較低，約為十幾萬分之一[9]，但在中國臺灣比例為1/8000～1/10000，中國香港則為1/15620[10-11]。在我國大陸主要見于南方地區，其中福建地區頻率大約為1/8500，而云南少數民族拉祜族中的頻率比較高，達2.2%[12]。中國人群中常見的類孟買血型多為分泌型，其FUT1基因型為h/h，其中常見的FUT1基因突變有h1（c.551-552delAG）、h2（c.881-882delTT）、h3（c.658C＞T）等。研究表明[13-14]，多數類孟買血型為FUT1 基因純合突變引起，少數由復合雜合突變引起。本例先證者為類孟買血型復合雜合突變，其FUT1 基因型為h1h2。

本實驗通過血型血清學發現先證者正定型為弱A型，反定型為Ac2+、Bc1+，血型結果表現為正反定型不符。進一步細胞吸收放散試驗也只檢測到弱A抗原，分析原因可能因先證者為分泌型，使血漿中少量H抗原吸附到紅細胞上，并繼續連接α-半乳糖。ABO基因分析顯示，先證者ABO血型的基因型為ABO*A1.02/B.01。FUT1基因分析顯示，先證者存在雙雜合缺失突變，分別為c.551-552delAG雜合缺失突變和c.881-882delTT雜合缺失突變。有文獻報道[15-16]，上述兩種突變均導致閱讀框架發生移碼，在氨基酸翻譯過程中提前出現終止密碼子，形成截短的α-1，2-L-巖藻糖基轉移酶，使酶活性大大減低，從而不能有效合成H抗原（即基因型h/h）。FUT2 基因分析顯示，先證者存在c.357C＞T純合多態性，此位點屬無意義突變，因未改變編碼的天冬酰胺，從而不影響α-1，2-巖藻糖基轉移酶活性[17]，故先證者仍表現為分泌型。

該家系調查顯示，先證者的母親、姐姐、哥哥和兩個女兒均為單鏈FUT1 基因突變攜帶者，符合類孟買血型隱性遺傳方式，只要存在一個有功能的FUT1 等位基因（基因型H/H或H/h），紅細胞即可表達H抗原[18]。因此，該家系其他成員的ABO血型表型均正常。先證者的母親和姐姐FUT1 基因均為c.880-882delTT雜合缺失突變，表明先證者和其姐姐FUT1 基因突變來自其母親；其哥哥FUT1 基因為c.551-552delAG雜合缺失突變，故推測可能來自其父親。由于條件受限，本研究未能獲取先證者父親血液，故無法對其基因突變位點進行直接驗證。

類孟買血型紅細胞上只有微量A和（或）B抗原，在常規血型血清學檢測中很難檢測到，因此常被誤定為其他血型。本研究通過血型血清學結合分子生物學技術，家系調查，探討了AB類孟買血型的分子生物學機制，為類孟買血型的正確鑒定和安全輸血提供了實驗依據。