基于方證相關探尋氣、血虛證物質基礎的蛋白質組學研究

梁華，梁爾新，李奇瑋，閆起，王燕，李澤光

(1.黑龍江中醫藥大學，黑龍江 哈爾濱 150040；2.黑龍江中醫藥大學附屬第一醫院，黑龍江 哈爾濱 150040)

方劑是研究治法與配伍規律及其臨床運用的學科，其功用效果的發揮與證侯密切相關。以方測證體現了中醫學辨證論治的思想，通過病、證動態演變特性來研究方劑與證候之間的相互關系。隨著現代醫藥科技迅猛的發展，特別是蛋白質組學(Proteomics)作為研究生理條件、突變情況及對抗外部因素產生應變的有力工具，能夠對于生物系統之間復雜作用及行為的系統生物學進行描述和預測[1],其具有較為出色的特征表現，諸如復雜性、整體性以及動態性等。這一點也和中醫學的觀念保持高度一致。為了明確經典名方四君子湯、四物湯[2]的抗衰老機制[3-9],本研究采用經典名方補益氣、血劑干預自然衰老小鼠肝細胞線粒體蛋白質組的變化，探尋自然生長小鼠增齡過程中伴隨氣、血虛證的物質基礎，為指導臨床辨證用藥提供科學依據。

1 材料

1.1 動物

SPF級40只ICR雌性小鼠，購自遼寧長生生物有限公司，許可證號:SCXK(遼)2010-0001。小鼠的飼養要求均為自然光照條件，室內溫度(22±2)℃，相對濕度55%±20%，對所有小鼠進行固體飼料飼養，自由攝食、飲水。

1.2 藥物

補氣劑四君子湯：白術9 g，人參9 g，茯苓9 g，炙甘草6 g，共33 g;補血劑四物湯：熟地黃12 g,當歸9 g,白芍藥9 g,川芎6 g,共36 g。制備方法：所有藥物加水浸泡后，加入10倍量水，分兩次進行煎煮，時長1 h，將煎煮后的藥液合并，濃縮至100 mL備用，補氣劑藥液濃度配置為0.33 g/mL，補血劑藥液濃度配置為0.36 g/mL，使用前加溫至37 ℃。

1.3 主要試劑

SDS、DTT、過硫酸銨、Urea、IAA、TEAB均來自美國Sigma-Aldrich公司；BCA蛋白濃度測定試劑盒、銀染試劑盒來自中國碧云天生物技術公司；ACN來自德國Merck KguA Darmstadt公司；二抗來自美國Santa Cruz；Monoclonal Anti-GAPDH antibody produced in mouse來自美國SIGMA 技術有限公司；iTRAQ Reagents-8plex來自美國AB Sciex公司。

1.4 主要儀器

電子分析天平AL204(上海梅特勒托利多儀器有限公司)；離心機(德國，eppendorf)；pH計(德國，inoLab)；蛋白電泳儀(美國，Bio-Rad)；冷凍干燥機(美國，Thermo Scientific)；超低溫冰箱(美國，Thermo Fi-sher)；安捷倫液相色譜儀1290 Infinity(美國，Agilent Technologies,Inc.)。

2 方法

2.1 實驗動物分組

40只SPF級ICR雌性小鼠，其中3月齡以及16月齡小鼠的數量分別為10只、30只。隨機選取10只3月齡雌性小鼠為空白組;30只16月齡雌性小鼠隨機分為模型組、四君子組、四物湯組，每組10只。

2.2 給藥方法

四君子湯組、四物湯組每天灌胃給藥劑量為13 mL/kg，空白組及模型組灌胃生理鹽水，劑量為13 mL/kg。

2.3 樣品處理

第30天禁食、自由飲水，經過24 h，處死小鼠，方式為頸椎脫位法，取材部位為完整肝臟，然后用冰生理鹽水清洗肝組織，用濾紙吸干水分,將肝組織剪成小塊后放入液氮中快速冷凍處理，保存至-80 ℃冰箱凍存待用。在進行樣本檢測前，選擇肝臟組織大小約為50～100 mg，剪切處理后于冰浴上進行勻漿，同時添加PMSF的線粒體分離試劑A，4 ℃ 15 000 r/min離心5 min，取其上清液，再次4 ℃ 12 000 r/min離心10 min，獲取的沉淀就是線粒體。

2.4 酶解和iTRAQ標記

采用FASP方法[10](蛋白濾膜輔助酶解)進行酶解，制取肽段。完成酶解后，使用100 μL TEAB buffe清洗2次，隨后在其中加入1% FA，此時溶液的濃度是0.1%，充分混合后，每管中加入20 μL，隨后對肽段凍干，在-80 ℃條件下凍存。凍干肽段樣品各取20 μg用于iTRAQ標記。

2.5 肽段分級

樣品溶解：100 μg的肽段用24 μL bufferA溶解，高速離心2遍，取20 μL上清液置于上樣瓶中。

2.6 LC-MS/MS分析

應用Easy nLC1000和orbitrap Elite液質聯用平臺對iTRAQ標記樣品進行數據采集。

2.7 生物學信息分析

使用Maxqunt軟件，對來自Orbitrap Elite所獲取的MS譜圖進行分析，將數據歸一化處理后，利用GO數據庫的各節點映射進行富集分析，之后進行KEGG通路分析，對顯著富集的通路，以KEGG網站提供的繪圖模塊進行渲染。

3 結果

3.1 蛋白定量結果

蛋白質含量與色氨酸的含量成正線性相關關系，因此可以通過測定蛋白質樣品中的色氨酸含量來計算蛋白質的濃度。

3.2 聚丙烯酰胺凝聚電泳檢測結果

分離膠的濃度12%，Marker上樣量4 μg， 每個樣品上樣量15 μg，進行SDS-PAGE凝膠電泳分析。結果顯示，蛋白質電泳結果條帶清晰，定量較為整齊，降解較少，見圖1。

圖1 蛋白條帶圖

3.3 差異蛋白篩選

差異蛋白篩選以sign.level≥2為條件，結合差異倍數(FOLD CHANGE>1.2或FOLD CHANGE<0.83)及P<0.05進行蛋白標志物的篩選，確保結果有較為出色的可靠保障。空白組與模型組共鑒定出差異蛋白數量是496個，上調以及下調的數量分別是257個、239個；四物湯組有237個標志性蛋白質出現了良性回調；四君子湯組有256個標志性蛋白質出現了良性回調；同時受到四物湯組、四君子湯組影響的蛋白有493個。

3.4 Gene Ontology分析

Gene Ontology是組學實驗常用的方法和工具，對研究有著極為重要的作用。本實驗借助GO數據庫富集分析，發現差異蛋白參與生物進程有類固醇代謝過程、蛋白質多泛素化、鈣離子運輸、mRNA加工、高爾基體、脂質代謝過程的正調控等，主要與胞外外泌體、細胞內核糖核蛋白復合物、高爾基體、核、細胞質等細胞組分有關；參與的分子功能有核苷酸結合、水解酶活性、氨肽酶活性、轉移酶活性、聚(A)RNA結合等，見表1。

表1 差異表達蛋白GO分析富集結果(前5位)

3.5 KEGG Pathway分析

KEGG是基因組破譯方面的數據庫，用于了解生物系統的分子水平表達。本實驗結果利用KEGG網站篩選的差異蛋白主要集中在內質網中的蛋白質加工、剪接體、脂肪消化吸收、細胞凋亡、阿爾茨海默病5條通路中，見表2。

表2 差異蛋白基因KEGG通路富集分析結果

4 討論

中醫學認為人體生命活動的物質基礎是氣和血，氣對人體有推動、溫煦、防御、固攝以及氣化作用；血對人體有濡養以及化神作用。因此有“氣為血之帥”“血為氣之母”的理論。本課題組認為機體的衰老與氣、血密切相關，同時發現小鼠飼養到16月齡后出現蜷縮少動、閉目、毛發脫落少光澤、鼠尾蒼白等現象，存在著氣血虧虛的癥狀。基于方證相關理論，我們認為通過補益氣血劑可以改善衰老相關性證候[11]。本實驗以蛋白質組學技術為依托，深入發現模型小鼠的肝細胞線粒體中存在與增齡相關的蛋白質生物標志物，經過補益氣血劑干預后回調了493個差異蛋白。通過對以上差異蛋白生物學功能及通路情況的分析，探求補益氣血劑與衰老進程中脾氣虛證相關的物質基礎。

實驗結果可見，差異蛋白主要參與的生物進程有類固醇代謝過程、蛋白質多泛素化、鈣離子運輸、mRNA加工、高爾基體、脂質代謝過程的正調控等；參與的分子功能有核苷酸結合、水解酶活性、氨肽酶活性、轉移酶活性、聚(A)RNA結合等；主要與胞外外泌體、細胞內核糖核蛋白復合物、高爾基體、細胞核、細胞質等細胞組分有關。

通路主要富集在內質網中的蛋白質加工、剪接體、脂肪消化吸收、細胞凋亡、阿爾茨海默病。

4.1 內質網中的蛋白質加工(Protein processing in endoplasmic reticulum)的調節

主要有以下蛋白參與了該途徑：Wolframin、鈣蛋白酶-1催化亞單位(Calpain-1 catalytic subunit)、蛋白質SEC13同源物(Protein SEC13 homolog)、內質網凝集素1(Endoplasmic reticulum lectin 1)、泛素結合因子E4 B ( Ubiquitin conjugation factor E4 B)。

Wolframin是由Wfs1基因編碼而成的蛋白質。Wolframin蛋白主要生理功能是分泌、膜的運輸、調控內質網鈣以及加工。INOUE等[12]1998年第一次發現WFS1基因。WFS1基因定位于人染色體4p16.1，由8個外顯子組成，其中最長片段是exon8，大約為2.6 kb。WFS1蛋白質或Wolframin蛋白質是WFS1基因編碼的跨膜糖蛋白質[13],大約由890個氨基酸組成[14]。Wolframin蛋白質主要位于內質網膜上,由細胞質N端親水部分、內質網腔的C端親水部分和中間疏水區域3個結構域，其包括了330～650的氨基酸[15]。YAMADA等人[16]發現小鼠胰島中的活性X盒結合蛋白1以及PERK磷酸化水平升高是由于WFS1基因缺陷引發的，其分子伴侶表達量的增長體現了內質網應激水平的增長；其次還伴隨著caspase-3裂解水平上升以及BrdU陽性細胞降低，并發現細胞周期的損傷和死亡都會比平時要快，導致此類現象的原因主是細胞周期的調節因子P21CIP1升高所致，但過度表達P21CIP1是影響細胞數量減少的主要原因，同時也表明P21CIP1的升高和WFS1基因缺陷胰島中β細胞數量減少。SHANG等[17]將Wolfram綜合征患者身上的皮膚纖維細胞體外誘導為多能干細胞，促使其能夠分化為β細胞, 進而發現缺陷的β細胞中胰島素含量在逐漸減少, 而內質網應激水平則會提升，在PERK、內質網跨膜蛋白肌醇激酶1和ATF6這3條主要的UPR通路活性都會相應提升：分子伴侶4-苯基丁酸能協助進行蛋白折疊, 這對于降低UPR信號通路活性具有幫助, 不僅如此，還能提升細胞內的胰島素，這表明WFS1基因對于β細胞具有一定的保護作用，見圖2。

4.2 阿爾茨海默病(Alzheimer's disease)的調節

主要有以下蛋白參與了該途徑：鈣蛋白酶-2催化亞單位(Calpain-2 catalytic subunit)、鈣蛋白酶-1催化亞單位(Calpain-1 catalytic subunit)、去整合素和含10蛋白的金屬蛋白酶結構域Amyloid-beta A4 protein淀粉樣βA4蛋白(Disintegrin and metalloproteinase domain-containing protein 10)、線粒體細胞色素C氧化酶亞基7C(Cytochrome c oxidase subunit 7C, mitochondrial)、1-磷脂酰肌醇4,5-二磷酸磷酸二酯酶β-3(1-phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate phosphodiesterase beta-3)、BH3相互作用域死亡激動劑(BH3-interacting domain death agonist)、半胱天冬酶-7(Caspase-7)。

鈣蛋白酶-2催化亞單位(Calpain-2 catalytic subunit)是由Capn2基因編碼而成的蛋白質，屬于鈣蛋白酶超家族的主要成員之一。鈣蛋白酶是一種降解肌纖維蛋白依賴鈣離子、半胱氨酸的蛋白酶，在動物組織中廣泛存在。鈣蛋白酶系統主要的參與對象是磷酸酶、細胞骨架、細胞凋亡、蛋白激酶以及激素受體。病理狀態下, 異常的鈣離子濃度能激活Calpain，進而造成組織損失從而影響了酶和蛋白質結構，并對細胞骨架、蛋白激酶產生降解作用。診斷阿爾茨海默病(AD)主要包括β淀粉樣蛋白1-42(Aβ1-42)濃度降低、細胞內的神經纖維纏結 (neurofibrillary tangle, NFT)。研究表明Ca2+信號異常是引發Calpain過度激活直接或間接影響AD的大腦病變[18]。LOPES等[19]研究發現大鼠腦皮層神經元通過Aβ40和prp106-126處理后，引發CDK5的異常，由合成胎處理后p25水平顯著增強，CDK5的抑制劑與鈣蛋白酶的抑制劑可改變tau蛋白的過磷酸化且能有效阻止神經元死亡。

半胱天冬酶-7(Caspase-7)是由Casp7基因編碼而成的蛋白質，其酶活性是完成凋亡細胞死亡所必需的，屬于半胱天冬酶的一個亞型結構。半胱天冬酶家族在哺乳動物的細胞凋亡途徑及細胞內凋亡信號的誘導、轉導和擴增中起著重要作用。Caspase3、Caspase6、Caspase7是Caspase家族中的凋亡執行因子。申雷娜[20]通過對早期胎停的絨毛組織中細胞凋亡情況進行檢測發現Caspase3、Caspase7對早期胎停的調控是通過凋亡路徑，并可作為妊娠初期篩查胚胎停止發育病因的分子標記物，見圖3。

結合上述觀點分析可知，補益氣血劑在抗衰老方面有著積極意義, 本文從蛋白質組學視角出發，就自然衰老小鼠中補益氣血劑干預價值進行分析。通過研究指出，16月齡模型組小鼠肝組織樣本中蛋白質標志物與3月齡空白組存在差異；補益氣血劑對16月齡小鼠肝組織內質網中的蛋白質加工、剪接體、脂肪消化吸收、細胞凋亡、阿爾茨海默病等途徑具有調節作用。通過調節這些信號通路的相關蛋白，進而對增齡產生的相關機體功能紊亂起到保護和調節作用。