基于有效基準特征圖譜質(zhì)量表征的中藥荷葉質(zhì)量評價研究

王夢林 巴寅穎 武秋紅 李文霞 路東波 高園園 孔靜 范圓圓 黃玉娟 孫仁弟 黃廣偉 姜艷艷 石任兵

荷葉為睡蓮科植物蓮NelumbonuciferaGaertn.的干燥葉，具有清暑化濕、升發(fā)清陽、涼血止血的作用[1]。荷葉作為藥食同源中藥品種，在保健品領域有著廣泛的應用。荷葉的藥效作用研究主要集中在減肥、調(diào)節(jié)脂代謝、抗氧化、降血糖等方面[2-7]。荷葉化學成份類型主要涉及黃酮類、生物堿類，以及有機酸類、甾類、揮發(fā)油類、蛋白質(zhì)類等[8-9]。其中黃酮類成分主要為金絲桃苷、異槲皮苷、槲皮素、紫云英苷等[10～11]，生物堿類成分主要為荷葉堿、O-去甲荷葉堿、2-羥基-1-甲氧基阿樸啡、蓮堿、去甲烏藥堿等[12-14]。2020版中國藥典以荷葉堿的含量作為荷葉飲片的質(zhì)量標準[1]。另有文獻報道：采用高效液相色譜(high performance liquid chromatography,HPLC)法對荷葉中6種黃酮類成分(槲皮素、蘆丁、金絲桃苷、山奈素、紫云英苷和異鼠李素)[15]、2種黃酮類成分(蘆丁、槲皮素)和1種生物堿類成分(荷葉堿)[16]進行含量測定；采用一測多評法測定荷葉中的4種生物堿(荷葉堿、N-去甲基荷葉堿、O-去甲基荷葉堿和蓮堿)含量[17]；采用HPLC法建立不同產(chǎn)地荷葉飲片的指紋圖譜，指認出2個黃酮類成分(蘆丁、金絲桃苷)和1個生物堿類成分(荷葉堿)，以蘆丁為參照，對11個共有指紋峰進行了相對保留時間、相對峰面積表征，對12批荷葉飲片進行相似度評價[18]；另有指認出1個黃酮類成分(槲皮素)，并以槲皮素為參照，對10個共有指紋峰進行了相對保留時間、相對峰面積表征，對10批荷葉飲片進行相似度評價[19]。

本研究在本課題組前期建立的基于藥物體系的中藥飲片質(zhì)量評價模式基礎上[20-25]，進一步開展基于有效基準特征圖譜質(zhì)量表征的中藥荷葉質(zhì)量評價，即以確定具有降血糖作用的荷葉飲片作為飲片基準，以其有效特征指標性成分荷葉堿作為質(zhì)量表征基準點，建立荷葉有效基準特征圖譜；繼而以荷葉堿對照品模擬基準點，得到11個特征峰的相對保留時間、相對峰面積；5個特征代表性成分，其中3種黃酮類成分(金絲桃苷、紫云英苷、異槲皮苷)和2種生物堿類成分(荷葉堿、O-去甲荷葉堿)的相對含量、含量換算系數(shù)；即涵蓋了荷葉的主要化學類型。并以基于此模擬基準點的荷葉飲片有效基準特征圖譜質(zhì)量表征信息作為其質(zhì)量評價標尺，應用于14批荷葉樣品質(zhì)量優(yōu)次的精準評價，同時也為有關藥物的質(zhì)量有效評價和控制提供了參考。

1 材料

1.1 主要儀器

沃特世2695型高效液相色譜儀，沃特世 2998 PDA檢測器，Empower軟件系統(tǒng)，自動進樣器，Sartorius BT 25S型1/100 000電子分析天平(北京賽多利斯儀器有限公司)，Sartorius BT 124S 型1/10 000電子分析天平(北京賽多利斯儀器有限公司)，KQ-500DE型數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)，SHB-Ⅲ型循環(huán)水式多用真空泵(上海振捷實驗設備有限公司)。

1.2 主要試藥與試劑

金絲桃苷對照品(批號B20631)、荷葉堿對照品(批號B20500)、O-去甲荷葉堿對照品(批號B51051)、異槲皮苷對照品(批號B21529)、紫云英苷對照品(批號B21704)，對照品均購自上海源葉生物科技有限公司，且純度均≥98%；乙腈(色譜級)購自 Fisher Scientific 公司；娃哈哈純凈水購自杭州娃哈哈集團有限公司；甲醇(分析純)，購自北京化工廠。15批荷葉飲片購自云南、北京、河北各藥店，北京中醫(yī)藥大學的劉春生教授鑒定其均為睡蓮科植物蓮NelumbonuciferaGaertn.的干燥葉。15批飲片樣品現(xiàn)均存放于北京中醫(yī)藥大學中藥學院中藥化學系，15批荷葉飲片編號、購買地及批號、產(chǎn)地見表1。

表1 荷葉飲片編號、購買地、批號及產(chǎn)地信息

2 方法與結(jié)果

2.1 荷葉有效基準特征圖譜質(zhì)量表征方法的建立

2.1.1 混合對照品溶液的制備 精密稱取金絲桃苷、異槲皮苷、O-去甲荷葉堿、紫云英苷、荷葉堿對照品6.85 mg、8.81 mg、2.35 mg、4.07 mg、6.48 mg，分別置于5 mL的容量瓶中，加入溶劑(70%甲醇溶液)，超聲并使其溶解后用溶劑定容至刻度線，分別搖勻，即得濃度為1.370 mg/mL、1.762 mg/mL、0.470 mg/mL、0.814 mg/mL、1.296 mg/mL的金絲桃苷、異槲皮苷、O-去甲荷葉堿、紫云英苷、荷葉堿對照品母液，精密吸取以上各母液適量于容量瓶中，加入70%甲醇稀釋，制備濃度為0.685 mg/mL、0.352 mg/mL、0.094 mg/mL、0.163 mg/mL、0.259 mg/mL的混合對照品溶液，備用。

2.1.2 供試品溶液的制備 稱取0.5 g荷葉飲片(基準)粗粉，精密稱定后將其轉(zhuǎn)移至50 mL錐形瓶中，精密加入30 mL 溶劑(70%甲醇)，加蓋瓶塞后稱定其質(zhì)量，加熱回流提取2小時，待錐形瓶冷卻至室溫后，稱定其質(zhì)量，用溶劑補足失重并搖勻，用微孔濾膜(直徑0.45 μm)濾過，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。

2.1.3 色譜檢測條件 Waters XBridge C18 色譜柱(4.6 mm ×250 mm，5 μm)，流動相為乙腈(A)-緩沖液(B)梯度洗脫(緩沖液組成為水∶磷酸∶三乙胺= 600∶1.2∶2.4)(梯度洗脫條件見表2)，柱溫為30 ℃，流速為0.8 mL/min，檢測波長為270 nm，進樣量為15 μL。混合對照品及荷葉供試品(基準)溶液的HPLC圖譜見圖1。通過11個特征峰的紫外吸收圖譜指認其所屬化學類型(如圖1)，色譜圖中所關注的11個共有特征峰分離度良好，其中，圖譜中1、2、7、10、11號特征峰屬于生物堿類化學成分，3～6、8、9號特征峰屬于黃酮類化學成分，該圖譜體現(xiàn)了荷葉主要化學成分類型(生物堿類和黃酮類)。11個特征峰中，5號、6號、8號特征峰分別是金絲桃苷、異槲皮苷、紫云英苷，屬于黃酮類；7號、11號特征峰分別是O-去甲荷葉堿、荷葉堿，屬于生物堿類。

注:A 荷葉樣品(270nm); B 混合對照品(270nm);1～2、10生物堿類；3～4、9黃酮類；5金絲桃苷；6異槲皮苷；7 O-去甲荷葉堿；8紫云英苷；11荷葉堿。

表2 HPLC梯度洗脫條件

2.1.4 有效基準特征圖譜方法學考察 (1)精密度考察：分別精密吸取“2.1.2”中荷葉飲片(基準)供試品溶液15 μL，連續(xù)進樣6次，選定荷葉堿為參照峰，計算各色譜峰與參照峰的相對峰面積、相對保留時間。計算結(jié)果顯示：各色譜峰的相對峰面積、相對保留時間的相對標準偏差(relative standard deviation,RSD)均分別小于1.87%、1.85%，表明儀器精密度良好，并且符合特征圖譜要求(RSD≤3%)[26]。(2)穩(wěn)定性考察：分別精密吸取同一個“2.1.2”中荷葉飲片(基準)供試品溶液15 μL，并于第0、2、4、8、12、24 小時分別對其進樣分析，選定荷葉堿為參照峰，計算各色譜峰與參照峰的相對峰面積、相對保留時間。計算結(jié)果顯示：各色譜峰的相對峰面積、相對保留時間的RSD均分別小于2.87%、2.75%，表明荷葉樣品溶液在24小時內(nèi)穩(wěn)定(RSD≤3%)[26]。(3)重復性考察：取同一批基準荷葉飲片，按照“2.1.2”項下方法制備供試品溶液，平行制備6份，對其分別進樣分析，選定荷葉堿為參照峰，計算各色譜峰與參照峰的相對峰面積和相對保留時間。計算結(jié)果顯示：各色譜峰的相對峰面積、相對保留時間的RSD均分別小于1.99%、1.96%，說明該方法重復性良好(RSD≤3%)[26]。

2.1.5 特征代表性成分含量測定方法學考察 (1)線性關系考察：精密吸取“2.1.1”項下的混合對照品溶液，用70%甲醇溶液稀釋，制備一系列濃度不同的混合對照品溶液，按照“2.1.3”項下的色譜檢測條件進樣檢測，測定各色譜峰面積。以對照品進樣量(μg)為橫坐標，峰面積為縱坐標繪制各對照品標準曲線，并計算回歸方程和相關系數(shù)。計算結(jié)果顯示，線性方程相關系數(shù)均大于0.99，符合測定要求(r≥0.99)[26]。結(jié)果見表3。(2)精密度考察：按照“2.1.3”項下的色譜檢測條件，分別精密吸取同一個“2.1.2”項下荷葉飲片(基準、S1)的供試品溶液 15 μL，連續(xù)進樣6次，測定金絲桃苷、異槲皮苷、O-去甲荷葉堿、紫云英苷、荷葉堿峰面積，以上各對照品峰面積RSD分別為0.83%、1.85%、1.62%、1.95%、1.26%，精密度良好(RSD均小于3%)，符合含量測定要求(RSD≤3%)[26]。(3)穩(wěn)定性考察：按照“2.1.2”項下方法制備荷葉飲片(基準、S1)的供試品溶液，于室溫下放置，并于制備后第0、2、4、8、12、24 小時，按照“2.1.3”項下色譜檢測條件進樣檢測，測定金絲桃苷、異槲皮苷、O-去甲荷葉堿、紫云英苷、荷葉堿峰面積，以上各對照品峰面積RSD分別為1.07%、1.80%、2.27%、2.63%、1.23%(RSD均小于3%)，表明荷葉供試品溶液在24小時內(nèi)穩(wěn)定(RSD≤3%)[26]。(4)重復性考察：按照“2.1.2”項下方法制備同一個荷葉飲片(基準、S1)的供試品溶液，平行制備6份，進樣，按照“2.1.3”項下檢測條件，測定金絲桃苷、異槲皮苷、O-去甲荷葉堿、紫云英苷、荷葉堿峰面積，計算得各對照品平均含量分別為0.5497%、0.2876%、0.0911%、0.1604%、0.5005%，RSD分別為1.21%、1.57%、1.93%、1.89%、0.87%，表明此方法重復性良好(RSD≤5%)[26]。(5)加樣回收率考察：精密稱取已知含量的荷葉飲片(基準、S1)粗粉，平行稱取6份，每份約0.5 g，置6個錐形瓶中，分別精密加入對照品溶液適量，然后按照“2.1.2”和“2.1.3”項下方法、色譜檢測條件分別制備供試品溶液并進樣檢測，測定峰面積后計算，金絲桃苷、異槲皮苷、O-去甲荷葉堿、紫云英苷、荷葉堿平均加樣回收率分別為98.72%、101.22%、100.82%、101.64%、100.59%，RSD分別為1.19%、0.54%、0.90%、1.06%、0.20%，該方法加樣回收率合格，且符合定量要求(回收率95%～105%；RSD≤3%)[26]。結(jié)果見表4。

表3 荷葉5個特征代表性成分線性關系及線性范圍(n=5)

表4 荷葉飲片5個特征性代表成分加樣回收率考察結(jié)果(n=6)

2.1.6 模擬基準點質(zhì)量表征考察 選定有效特征指標性成分荷葉堿作為質(zhì)量表征基準點。精密稱取4.20 mg荷葉堿對照品于5 mL容量瓶中，加70%甲醇溶液，超聲使其溶解后定容至刻度并搖勻，即得濃度為0.840 mg/mL的荷葉堿對照品母液，精密量取該對照品母液1 mL于10 mL容量瓶中，加70%甲醇稀釋，即得濃度為0.084 mg/mL的對照品溶液作為模擬基準點，該對照品溶液與“2.1.2”項下制備的荷葉飲片(S1)供試品溶液中所檢測的荷葉堿含量相同，按照“2.1.3”項下條件進樣檢測，得模擬基準點的HPLC色譜圖見圖2和表5。

注：11 荷葉堿

表5 荷葉質(zhì)量表征基準點質(zhì)量表征結(jié)果

由表5可知，荷葉堿對照品(模擬基準點)與飲片(基準)供試品中荷葉堿(實測基準點)的保留時間(min)、峰面積相對偏差絕對值均小于3%，二者基本吻合，表明本檢測方法及其測定結(jié)果、模擬荷葉質(zhì)量表征基準點的準確性，即荷葉堿對照品溶液(0.084 mg/mL)可作為模擬質(zhì)量表征基準點。

2.2 荷葉質(zhì)量表征信息研究

有效基準特征圖譜中11個特征峰的保留時間(min)、峰面積(以100 mg荷葉飲片計)、含量，基于模擬基準點得到的相對保留時間、相對峰面積及相對含量、換算系數(shù)(特征代表性成分的相對含量與相對峰面積的比值)結(jié)果見表6。

由表6可知，基于模擬基準點得到的11個特征峰及其相對峰面積、相對保留時間，5個特征代表性成分的相對含量，即為荷葉有效質(zhì)量基準標尺。

表6 荷葉飲片(基準、S1、以100 mg計)有效基準特征圖譜質(zhì)量表征信息

2.3 荷葉質(zhì)量評價及驗證

取14批待評價的荷葉飲片樣品粗粉，按照“2.1.2”項下的方法分別制備供試品溶液(每個樣品平行制備3份)，按照“2.1.3”項下條件進樣檢測，得到各批飲片質(zhì)量表征信息，同時實測基準荷葉飲片(S1)有效基準特征圖譜，以及14批待評價荷葉飲片特征性代表性成分(金絲桃苷、異槲皮苷、紫云英苷、荷葉堿、O-去甲荷葉堿)含量，以驗證基于質(zhì)量標尺對荷葉飲片進行質(zhì)量評價具有準確性。結(jié)果如圖3、4、5、6以及表7所示：

注：1～2、10生物堿類；3～4、9黃酮類；5金絲桃苷；6異槲皮苷；7 O-去甲荷葉堿；8紫云英苷；11荷葉堿

圖4 14批荷葉飲片與基準(S1)相對保留時間

圖5 14批荷葉飲片與基準(S1)的相對峰面積

圖6 14批荷葉飲片與基準(S1)的相對含量

如圖3、4所示，14批荷葉飲片特征圖譜均含有11個相同的特征峰，且11個特征峰相對保留時間與實測值相吻合，與基準標尺基本一致。結(jié)果表明：14批樣品均為荷葉飲片，并且驗證了本文應用基準標尺辨別荷葉飲片真?zhèn)尉哂袦蚀_性。

通過圖5、6可知所關注的14批荷葉飲片的質(zhì)量表征信息，綜合考量其特征峰的相對峰面積和相對含量、及其高于基準標尺對應點的數(shù)目、高出的幅度及其所涵蓋的主要化學類型及所含荷葉堿同類成分，評估得出S14、S4、S9、S13、S8、S11、S7、S6質(zhì)量較優(yōu)。

由表7可得，換算含量值與實測含量值基本一致(均為P>0.05)，此結(jié)果驗證了特征代表性成分換算含量結(jié)果及其相對含量結(jié)果具有準確性。

綜上所述，得出結(jié)論：可選定荷葉堿對照品作為模擬基準點，并以此模擬基準點為基準表征有效飲片基準，所表征的有效飲片基準質(zhì)量表征信息可作為標尺，表征并評價待測飲片的質(zhì)量。

3 討論

筆者對供試品溶液的制備方法進行考察，考察后得出：70%甲醇溶液60倍量回流提取1次，提取2小時，效果最佳，可將荷葉飲片中生物堿類和黃酮類成分提取完全，故選用此法制備供試品溶液。

在采用HPLC-PDA法建立荷葉有效基準特征圖譜質(zhì)量表征方法時分別對流動相和檢測波長進行了考察，考察后得到最優(yōu)色譜條件：流動相為乙腈-磷酸(0.2%)-三乙胺水(0.4%) ，檢測波長為 270 nm。

在對各特征峰峰面積進行質(zhì)量表征時，峰面積均以100 mg荷葉飲片計，即，將峰面積換算為每100 mg樣品下各特征峰的峰面積，以消除由于稱樣量不同而帶來的誤差。

本研究以自然藥學觀藥物體系為導向[27-30]，以降糖有效的荷葉為飲片基準，選擇其特征指標性成分荷葉堿為質(zhì)量表征基準點，以主要化學類型且具有降糖活性的特征代表性成分(金絲桃苷、異槲皮苷、紫云英苷、荷葉堿、O-去甲荷葉堿)[31-33]為質(zhì)量考察指標，因而所構(gòu)建的基準特征圖譜質(zhì)量表征方法充分體現(xiàn)荷葉質(zhì)量的整體性、特征性、有效性；且以荷葉堿對照品模擬基準點，實現(xiàn)一測多評，可使得本評價方法具有準確性、便捷性、經(jīng)濟性和可行性。研究應用于對14批荷葉飲片質(zhì)量優(yōu)良度評價： S14、S4、S9、S13、S8、S11、S7、S6樣品質(zhì)量較優(yōu)。本研究以一種新的模式去評價荷葉飲片的質(zhì)量，可為荷葉及其制備物質(zhì)量有效精準評價與控制提供方法、模式借鑒。