甲炎康泰對自身免疫性甲狀腺炎大鼠PI3K/Akt/mTOR信號通路的影響

張秋娥 潘雅婧 張程斐 趙丹 吳麗麗 秦靈靈 劉銅華

自身免疫性甲狀腺炎(autoimmune thyroiditis，AIT)是由于多因子功能紊亂導致的一種器官特異性自身免疫性疾病，其臨床診斷通過血清甲狀腺過氧化物酶抗體(thyroid peroxidase antibody，TPOAb)和抗甲狀腺球蛋白抗體(anti-thyroglobulin antibodies，TgAb)的陽性表達以確診[1]。目前遺傳易感性、環境因素、營養因素和免疫紊亂是公認的導致AIT發生的重要因素[2-3]，但其病因未完全闡明，尚無針對病因的治療手段。

磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K)/蛋白激酶B(protein kinase B，Akt)/哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)信號通路長期以來被認為是細胞代謝、生長、存活的關鍵調節因子，mTOR是細胞內自噬的主要抑制因子，它受到PI3K/Akt通路的正調節。臨床研究通過提取橋本甲狀腺炎患者甲狀腺濾泡上皮細胞進行研究，發現自噬相關蛋白減少。甲狀腺濾泡細胞自噬參與了橋本甲狀腺炎的發展[4]，激活PI3K/Akt/mTOR信號通路使AIT的癥狀加重[5-6]。因此，研究組推測甲炎康泰可能作用于PI3K/Akt/mTOR信號通路，參與了對細胞自噬的調節作用來改善AIT病情。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

SPF級Lewis大鼠30只，6周齡，雌性，體質量115～145 g。購于北京維通利華實驗動物技術有限公司，許可證號：SCXK(京)2016-0006。

1.2 實驗藥物

甲炎康泰組方：柴胡10 g、郁金20 g、夏枯草30 g、穿山龍10 g、浙貝母15 g、玄參10 g、山慈菇6 g、黃芪30 g、烏梅15 g。甲炎康泰顆粒劑購于北京康仁堂藥業有限公司，溶于去離子水，置于4℃冰箱儲存。參考課題組前期實驗結果，本實驗給藥劑量2.834 g/kg[7]。

1.3 實驗試劑

碘化鈉(瑪雅試劑有限公司產品，批號：MA-YA-CR-2831)，豬甲狀腺球蛋白(Thyroglobulin from Porcine thyroid gland，PTg)(美國Sigma公司，批號：#018K7012)，弗氏不完全佐劑(Incomplete Freunds Adjuvant，IFA)(美國Sigma公司，批號：#SLCB8702)，弗氏完全佐劑(Complete Freunds Adjuvant，CFA)(美國Sigma公司，批號：#SLCF1289)，TPO-Ab Elisa kit(CUSABIO，批號：CO331050347)，Trizol(美國Ambion公司)，異丙醇(北京化工廠)，PCR試劑盒(南京維諾贊生物科技股份有限公司)，BASO脫蠟劑(珠海貝索生物技術有限公司，批號：C210702)，無水乙醇(北京化工廠)，伊紅(美國Sigma公司)，PI3KCA(proteintech公司，貨號：20583-I-AP)，Anti-Akt1 (phospho S473)(Abcam公司，批號：GR150067-1)，Phospho-mTOR (Ser2448)(CST公司)，蘇木精染色液(北京普利萊基因技術有限公司，貨號：C1411)，羊血清工作液(北京中杉金橋生物技術有限公司，批號：2109D0617)，DAB顯色試劑盒(北京普利萊基因技術有限公司，批號：20A1CB1072)，中性樹膠(北京普利萊基因技術有限公司)。GAPDH、PI3K、Akt、mTOR基因的PCR引物均由上海生工生物工程股份有限公司設計、合成(引物序列及引物長度見表1)。

乳化劑的配制：實驗時將1 mg PTg溶于1L PBS得到0.1% PTg溶液，再按等體積比例將該溶液與CFA研磨混合成乳劑得到終濃度0.05% PTg-CFA乳劑；同法配制0.05% PTg-IFA乳劑。碘化鈉水溶液的配制：100 mL去離子水中加入64 mg NaI，配制成0.064% NaI溶液。

以上試劑現用現配，碘化鈉水溶液注意避光。

1.4 實驗儀器

臺式高速冷凍離心機(德國SIGMA公司，3K15)；Thermo labsystem MK3酶標儀(美國Thermo公司)；OLYMPUS BH-2光鏡(日本奧林巴斯公司)；全自動新型電熱培養箱(上海智誠分析儀器制造有限公司)；其他手術相關器械。

1.5 實驗方法

1.5.1 動物分組與造模 建立AIT模型[8]：根據體質量，采用區組隨機法選取10只Lewis大鼠為正常對照組，其余為造模組。第一周適應性喂養正常進食飲水，第二周開始AIT造模，造模組Lewis大鼠自由飲用0.064% NaI溶液，正常對照組Lewis大鼠自由飲水。第3周造模組Lewis大鼠行初次免疫：每次在每只Lewis大鼠雙側腹股溝皮下、背部皮下、頸部皮下多點注射PTg-CFA乳劑0.2 mL，此周皮下注射2次，間隔三天。加強免疫：第4～8周配制PTg-IFA乳劑進行每周1次的皮下多點注射。造模成功驗證方法：采集大鼠眶靜脈血，Elisa法檢測大鼠血清中TPOAb抗體水平。

1.5.2 給藥方法 造模結束后，根據TPOAb濃度，將成模大鼠隨機分為模型組與甲炎康泰組，每組10只，第8周開始給藥。甲炎康泰組大鼠給予甲炎康泰水溶液灌胃，其余組予等體積去離子水灌胃，灌藥體積為1 mL/100 mg，每日一次。連續給藥8周。

1.5.3 取材方法 各組大鼠灌胃干預8周后，禁食12小時，腹腔注射2%戊巴比妥鈉溶液(40 mg/kg)，麻醉后行腹主動脈取血，負壓真空采血管采集外周血，室溫靜置后離心(4℃，3 000r/min)10分鐘，吸取上清，-80℃冰箱超低溫保存，用于后續血清指標檢測(本實驗中每組取6只大鼠血清進行Elisa檢測)；每組取6只大鼠的甲狀腺組織用于后續蘇木精—伊紅(hematoxylin-eosin，HE)染色以及免疫組織化學檢測，另一側甲狀腺組織進行PCR檢測(因RNA純度問題，最終本實驗中用4只)。

1.6 指標檢測

1.6.1 血清抗體檢測 Elisa法檢測大鼠外周血清中TPOAb抗體水平。按說明書：酶標板加10 μL標準品、樣品，另設空白孔，加一抗50 μL(空白孔不加)，37℃恒溫培養箱1小時，wash buffer洗板后加入二抗50 μL，37℃恒溫培養箱30分鐘，洗板完畢加顯色液避光顯色15分鐘，酶標儀讀取OD值，擬合標準曲線計算TPOAb濃度。

1.6.2 病理變化觀察 取甲狀腺組織，石蠟包埋，切片，二甲苯脫蠟，梯度乙醇脫水，自來水低速沖洗，蘇木精染色5分鐘，加0.5%的鹽酸，加入0.5%的氨水回藍30秒，伊紅溶液染色2分鐘，乙醇梯度處理，二甲苯浸泡，封片，鏡下觀察病理變化。

1.6.3 實時熒光定量PCR(real-time quantitative PCR，qRT-PCR) 采用逆轉錄定量PCR方法檢測甲狀腺組織中PI3K、Akt、mTOR mRNA的表達。Trizol法提取甲狀腺組織RNA后，利用反轉錄試劑盒，根據說明書，以37℃，15分鐘；85℃，5秒進行反轉錄。PCR反應體系：10 μL SYBR qPCR Master Mix，0.04 μL上引，1 μL下引，2μL cDNA稀釋液，7.92 μL dH2O。PCR擴增依據廠商說明書條件：95℃預變性30秒；95℃變性5秒，退火60℃延伸30秒，循環反應40次，95℃，15秒，60℃持續60秒，采集溶解曲線，最后統計Ct值，結果以GAPDH為內參，正常組樣本為對照，采用2-△△Ct相對定量法比較各組目標mRNA的表達差異。引物序列見表1。

表1 qRT-PCR引物

1.6.4 免疫組織化學分析 甲狀腺組織石蠟包埋切片后脫蠟復水，Trition、3%H2O2處理，檸檬酸鹽溶液高溫抗原修復，山羊血清封閉，滴加一抗4℃，12小時后復溫PBS沖洗，滴加二抗，DAB顯色，蘇木精染色，自來水低速沖洗，酒精梯度脫水，BASO脫蠟劑浸泡，滴加中性樹膠封片。鏡下拍照分析，運用Image-Pro Plus6.0，Media Cybernetics系統進行吸光度檢測，分析PI3K、P-Akt、P-mTOR的平均光密度(IOD/Area)，進行統計學處理。

1.7 數據處理

2 結果

2.1 各組大鼠外周血中TPOAb濃度測定

與正常組大鼠比較，模型組大鼠外周血TPOAb滴度值均升高(P<0.05)。與模型組相比，甲炎康泰組TPOAb滴度值降低，差異具有統計學意義(P<0.05)。見表2。

表2 各組大鼠血清TPOAb含量比較

2.2 各組大鼠甲狀腺病理觀察

200倍鏡下可見正常組大鼠甲狀腺濾泡上皮細胞排列整齊，濾泡圓形完整，濾泡腔內膠質豐富，未見淋巴細胞等浸潤；與正常組對比，模型組AIT大鼠甲狀腺濾泡上皮細胞可見明顯破壞，濾泡部分萎縮甚至消失，濾泡腔內膠質減少，濾泡間隙可見明顯浸潤淋巴細胞；甲炎康泰組大鼠甲狀腺濾泡上皮細胞較完整，濾泡形態較規則，鏡下可見膠質略少，甲狀腺濾泡細胞間偶見淋巴細胞浸潤，與模型組比較普遍輕微。見圖1。

注: A 正常組；B 模型組；C 甲炎康泰組。

2.3 各組大鼠甲狀腺組織中PI3K、Akt、mTOR的mRNA表達情況

模型組大鼠甲狀腺組織PI3K、Akt、mTOR的mRNA表達較正常組顯著升高(P<0.05)；與模型組比較，甲炎康泰組PI3K、Akt、mTOR的mRNA表達降低，差異具有統計學意義(P<0.05)。見表3。

表3 各組大鼠甲狀腺組織PI3K、Akt、mTOR的mRNA表達情況比較

2.4 各組大鼠甲狀腺組織中PI3K、P-Akt、P-mTOR蛋白表達情況

400倍鏡下可見各組大鼠甲狀腺組織PI3K、P-Akt、P-mTOR免疫陽性物呈棕色，計算并統計平均光密度值，正常組大鼠甲狀腺組織內有較少PI3K、P-Akt、P-mTOR蛋白表達，模型組大鼠PI3K、P-Akt、P-mTOR蛋白均為陽性表達。與模型組比較，甲炎康泰組PI3K、P-Akt、P-mTOR蛋白表達減少(P<0.05)，見表4，圖2、3、4。

表4 各組大鼠甲狀腺組織PI3K、P-Akt、P-mTOR蛋白表達比較

注: A 正常組；B 模型組；C 甲炎康泰組。

注: A 正常組；B 模型組；C 甲炎康泰組。

注: A 正常組；B 模型組；C 甲炎康泰組。

3 討論

AIT是一種常見的器官特異性自體免疫性疾病，起病隱匿,病程較長,病情反復，常合并其他自身免疫性疾病[9-11]，可引起女性不孕、流產[12]、脫發[13]等。除了軀體并發癥，患者也可能出現精神障礙，如抑郁癥、焦慮癥[14]等。AIT遷延不愈，可導致甲亢反復發生，可并發甲狀腺結節，最終導致甲狀腺功能減退而不得不采用替代治療[1]。AIT發病主要是自身免疫耐受被破壞的結果，細胞和體液免疫反應，特異性地影響特定組織[15-17]，其中T淋巴細胞直接破壞甲狀腺組織，導致一系列連鎖反應，其分泌的細胞因子等可通過觸發和增強免疫應答及炎性反應而加劇AIT病變[15]。

PI3K/Akt/mTOR信號通路作為自噬的經典途徑，已被證明在AIT的發生發展中起著重要作用[6,18-20]，此通路是由一系列不同的反應通過特定的受體激活的生長因子(包括激素、細胞因子和趨化因子)通過各種機制激活PI3K。PI3K啟動磷酸肌醇-3激酶調控通路，特異性結合Akt和磷酸肌醇依賴的蛋白激酶1(phosphoinositide-dependent protein kinase-1，PDK1)，促進PDK1對Akt磷酸化和激活[21]，Akt間接激活mTOR，當TSC2在Ser939被激活的Akt磷酸化時，它從TSC1分離出來[22]，導致mTORC1的激活，mTORC1直接磷酸化下游底物，抑制自噬[23]。自噬是一種保守的細胞過程，涉及自噬體的形成，自噬體包裹著細胞質貨物，包括長壽命蛋白質、蛋白質聚集體和細胞器，并將這些貨物輸送到溶酶體進行降解[24]。最新研究已經證明了自噬在先天性和適應性免疫反應中的重要作用[24-26]。T細胞在胸腺從分化到成熟、在外周的存活和其功能受到自噬水平的影響[26]。此外，自噬的誘導促進了抗原肽遞送到主要組織相容性復合物II類負載區，并隨后表達到CD4+T細胞[27-28]。自噬過程參與了自身免疫和炎性疾病的發展，對免疫和炎癥的有益和有害影響起到了平衡作用[29]。T細胞消融引起嚴重的自身免疫反應，與mTOR激活和代謝重編程有關，這些激活引起外周T細胞的自發激活和加速分化，藥物性mTOR抑制劑對T細胞缺陷和免疫調節障礙有積極作用[30]。

AIT可歸屬于中醫“癭病”“癭瘤”等范疇，中醫藥特色治療在AIT的治療方面有著獨特優勢[31]。甲炎康泰(專利號CN106421633A)由柴胡、郁金、夏枯草、穿山龍、浙貝母、玄參、山慈菇、黃芪、烏梅組方而成，是劉銅華教授在多年臨床治療中不斷總結而成的療效明確的經驗方。本病誘因主要為情志失調，致肝郁氣滯。肝郁犯脾，脾虛痰積，氣滯、痰結瘀阻于頸前，日久因實致虛，傷陰耗氣，損及陰陽。因此，甲炎康泰全方功以疏肝理氣，可達到消痰散結化瘀的治療目的[32]。

前期研究顯示，甲炎康泰能降低Th17/Treg比例，下調血清白介素(interleukin，IL)-6、IL-17A、IL-23p19、轉化生長因子-β1等Th17相關細胞因子分泌，上調血清IL-2、IL-10等Treg相關細胞因子分泌[33]，糾正Th1/Th2失衡[34]。本次實驗結果表明，與模型組相比，甲炎康泰組大鼠外周血TPOAb滴度降低，給藥甲炎康泰干預后甲狀腺組織淋巴細胞浸潤減輕，一定程度上緩解了AIT病情。相比模型組，甲炎康泰組甲狀腺組織中PI3K、Akt、mTOR mRNA相對表達量明顯下降，PI3K、P-Akt、P-mTOR蛋白表達量明顯下降。因此，甲炎康泰可能通過抑制PI3K/Akt/mTOR信號通路，促進細胞自噬，來維持T細胞穩態，進而減輕炎癥反應，延緩AIT發生發展。

綜上所述，甲炎康泰治療AIT可能與其能夠抑制PI3K/Akt/mTOR信號通路有關。但本實驗僅初步驗證了甲炎康泰對于PI3K/Akt/mTOR信號通路的調節作用，下游靶蛋白等尚未進行驗證，與其他信號通路是否有協同作用，也有待更進一步的實驗探索。