振腹法對多囊卵巢綜合征大鼠性激素水平及炎癥因子腫瘤壞死因子-α、白介素-6的影響

謝丹丹 耿楠 李晶磊 趙思雨 李拓 趙峻嘹 付國兵 沈潛

多囊卵巢綜合征(polycystic ovary syndrome, PCOS)是一種以高雄激素血癥、無排卵或排卵、肥胖、痤瘡、多毛等為典型臨床特征的婦科內分泌疾病。PCOS多發于生育期女性，是導致育齡期婦女不孕的最常見原因之一。據相關臨床報道，本病發病率為6%～15%[1]，且患者產科疾病、心血管疾病、心理疾病以及遠期并發癥的風險增加，嚴重危害女性健康和生活質量[2-3]。研究表明，慢性低度炎癥反應是PCOS發生發展的重要原因[4]。目前中醫治療PCOS療效確切，其中推拿療法是我國中醫傳統特色外治手法[5]，已有臨床研究[6, 7]證實中醫腹部推拿能明顯改善PCOS患者的癥狀及炎癥反應。振腹法是作用于腹部神闕穴的一種特色手法，基于以上前提，本文旨在探討振腹法對PCOS大鼠體質量、性激素水平以及相關炎癥因子水平的影響，從而為臨床研究提供科學證據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

SPF級SD大鼠24只，雌性，6周齡，體質量(180±20) g，24只購于北京維通利華實驗動物技術有限公司，生產許可證編號：SCXK(京)20166-0006，按隨機數字表法分為空白組、模型組、二甲雙胍組、振腹組，每組6只。屏障環境下室內溫度(23±1)℃，濕度(45±5)%，日光燈光照，普通清潔級鼠飼料飼養，自由飲水。

1.2 實驗藥物

來曲唑：0.25 mg/片×10片/盒，生產批號：200308KB，江蘇恒瑞醫藥股份有限公司。二甲雙胍：0.5 g/片×20片/盒，生產批號：A890259，中美上海施寶貴制藥有限公司。1%羧甲基纖維素鈉溶液(Coolaber，批號：C9230)。堿性美藍染液(泰科美生物科技有限公司)。

1.3 主要試劑及儀器

促黃體生成素測定試劑盒(武漢云克隆科技股份有限公司，CEA441Ra)、促卵泡激素測定試劑盒(武漢云克隆科技股份有限公司，CEA830Ra)、血清雄激素測定試劑盒(武漢云克隆科技股份有限公司，CEA458Ge)、血清雌激素測定試劑盒(武漢云克隆科技股份有限公司，CEA461Ge)、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α, TNF-α)測定試劑盒(武漢云克隆科技股份有限公司，KSA133Ra01)、白介素-6(interleukin-6, IL-6)檢測試劑盒(武漢云克隆科技股份有限公司，SEA079Ra)；電子天平、移液槍、離心機(恒諾儀器 AXTGL16M)、切片機(Leica RM2235)、石蠟包埋機(Leica G1150H)、I-Sanger生信云平臺(hTTps://www.i-sanger.com/)、酶標儀(Thermo, MULTISKAN MK3)。

1.4 PCOS大鼠模型的建立

選擇芳香花酶抑制劑造模法[8]，來曲唑8 mL/(kg·d), 0.125 mg/mL溶于1%羧甲基纖維素鈉中，模型組及振腹組大鼠連續灌服21天；空白組灌服等濃度等體積羧甲基纖維素溶液21天。

模型建立成功的評定標準[8]：(1)陰道涂片觀察大鼠動情周期的改變。從造模第7天起直至造模第21天(3個動情周期)，每日上午8:00～9:00，用生理鹽水浸潤的小棉簽在大鼠陰道內順時針旋轉1圈后抽出，將大鼠陰道分泌物逆時針旋轉均勻涂抹于載玻片上，95%酒精脫水、固定后，用美蘭染色5分鐘,顯微鏡下觀察細胞形態。造模成功評價：涂片中細胞持續1周以白細胞為主，未見陰道角化細胞，提示大鼠動情周期失常，且處于動情間期、無排卵。(2)血清睪酮檢測，造模第21天晚7點禁食12小時，次日早上每組大鼠各隨機取1只大鼠眼眶后靜脈叢采血，分離血清用于ELISA法檢測血清睪酮水平。造模成功評價：模型組、二甲雙胍組、振腹組大鼠血清睪酮較空白組均顯著升高(P<0.05)。符合以上2項，可確定造模成功。造模過程中無大鼠死亡。

1.5 干預方法

1.5.1 二甲雙胍組 予二甲雙胍溶于4 mL/(kg·d)的1%羧甲基纖維素鈉溶液灌服：根據第九版教材《婦產科學》，二甲雙胍治療PCOS常用劑量為每次口服500 mg，每日3次[9]；按照《醫學實驗動物學》中人與動物藥物劑量換算方法[10]，換算后大鼠給藥劑量為43 mg/(kg·d)，第22天起給藥，連續給藥15天。

1.5.2 振腹組 操作者手法干預之前進行振腹手法操作規范化培訓，且所有大鼠干預均由同一名操作者完成，手法干預完一只大鼠，休息5分鐘后再進行下一只大鼠手法干預。具體干預操作如下：

操作者左手固定大鼠，使大鼠腹部朝上，參照《實驗針灸學》[11]選取神闕穴。根據類比法，人手中指指腹面積與大鼠前爪面積近似相等，故選取右手中指置于大鼠神闕穴，進行振腹法操作，每只大鼠每次操作15分鐘，第22天起開始干預，連續干預15天。手法干預過程中，大鼠未出現應激反應。實驗過程中對動物的處理均符合北京中醫藥大學東方醫院動物倫理委員會要求。

1.6 取材與檢測指標

1.6.1 樣本采集 大鼠于第35天最后一次干預后禁食12小時，腹腔注射2%戊巴比妥鈉50 mg/kg，大鼠昏迷后，腹主動脈取血4 mL，靜置30分鐘，放入多孔離心機中，3 000 r/min，4℃離心15分鐘，取上清液注入一次性EP管內密封，-80℃冰箱保存；取出雙側卵巢，眼科剪去除卵巢表面脂肪組織、包膜及輸卵管，生理鹽水沖洗后紗布吸拭表面水分，分別將雙側卵巢用4%多聚甲醛固定或-80℃冰箱保存。

1.6.2 卵巢形態學觀察 選取大鼠左側卵巢，4%多聚甲醛固定24小時，經脫水后制作石蠟包埋切片，蘇木精—伊紅(hematoxylin-eosin，HE)染色，光鏡下觀察卵巢組織學特點。

1.6.3 血清性激素及炎癥因子水平檢測 取各組大鼠血清，按照ELISA試劑盒說明書檢測血清性激素及炎癥因子水平。采用酶標儀在450 nm波長處測定各孔的A值，根據標準曲線計算血清中促黃體生成素(luteinizing hormone,LH)、卵泡刺激素(follicle stimulating hormone,FSH)、雌二醇(estrogen,E2)、睪酮(testosterone,T)、TNF-α、IL-6的含量。

1.7 統計學分析

2 結果

2.1 大鼠卵巢組織形態學變化

與空白組比較，模型組大鼠卵巢形態HE染色切片呈顯著性改變，出現較多的囊性卵泡，且顆粒細胞減少，二甲雙胍組及振腹組大鼠卵巢形態與模型組相比，囊性卵泡減少。見圖1。

注: A空白組；B模型組；C 二甲雙胍組；D振腹組

2.2 大鼠血清性激素水平

與空白組相比，模型組、二甲雙胍組的LH、FSH、T水平均顯著升高(P<0.05)，E2水平降低(P<0.05)；振腹組T水平升高，E2水平降低(均P<0.05)。與模型組對比，二甲雙胍組、振腹組LH、FSH、T水平均降低(P<0.05)，E2水平升高(P<0.05)。與二甲雙胍組比較，振腹組LH、T水平降低(P<0.05)，E2水平升高(P<0.05)，FSH水平低于二甲雙胍組，差異不具有統計學意義(P>0.05)。見表1。

表1 各組PCOS大鼠血清性激素水平比較

2.3 大鼠血清炎癥因子水平

與空白組相比，模型組大鼠TNF-α、IL-6水平顯著升高(P<0.05)；二甲雙胍組IL-6水平升高(P<0.05)。與模型組比較，二甲雙胍組與振腹組大鼠TNF-α、IL-6水平均顯著降低(P<0.05)。與二甲雙胍組比較，振腹組TNF-α水平降低、IL-6水平升高，但無明顯統計學差異(P>0.05)，如表2。

表2 各組PCOS大鼠血清炎癥因子水平比較

3 討論

中醫學認為多囊卵巢綜合征屬于“不孕”“經遲”“閉經”“月經過少”等范疇[5]，本病的病機為腎虛、脾虛、肝郁、沖任損傷、天癸失序、痰瘀胞宮等，與腎、脾、肝三臟有關。腎虛為本，腎精不足，則會影響對肝脾的滋養；沖任損傷、天癸失序，血海不能充盈，則出現女性月經延期，嚴重者陰血匱乏，陰陽失調，繼而出現閉經、不孕。腎虛易致血瘀，一者氣虛推動無力而致瘀，或氣虛統攝無力致血不歸經；再者元陽不足，溫煦無力則血脈寒澀難行，如冬日寒至則水凝，血為陰類，賴陽以動，無陽則冰結而為瘀。痰瘀互結于胞宮，阻礙氣血運行，則致不孕、月經后期或閉經、卵巢多囊樣改變；痰瘀泛溢于肌膚，可見形體肥胖、多毛、痤瘡等。

腹部與臟腑氣血有著密切聯系。《靈樞·脹論》載：“臟腑之在胸脅腹里之內也……夫胸腹，臟腑之郭也。”清代醫家張振鋆的《厘正按摩要術》也稱：“胸腹者，五臟六腑之宮域，陰陽氣血之發源。”因此，腹部為元氣歸藏之所。胃氣為后天動力，先天之根本元氣得后天水谷充養以源源不絕，故人以胃氣為本。臟腑功能正常與否，人體的發病、預后轉歸均與元氣、胃氣的盛衰息息相關。朱震亨《丹溪心法》中記載：“有諸內者，必形諸外。”臟腑功能出現異常時，其陰陽氣血虛實可通過胸腹部表現出來。腹部是醫者，尤其是推拿醫者觸及探知患者體內臟腑陰陽氣血情況的重要部位，同時通過腹部按摩，影響胃氣、元氣起到調整臟腑之陰陽氣血虛實的功用。

振腹法是由全國第五批名老中醫臧福科教授創立及其弟子付國兵教授等三代人發展而來，對治療內、婦、兒科等多種疾病都有一定療效[12-14]，其操作主要以醫者手掌掌心勞宮穴正對患者腹部神闕穴，中指對應患者任脈，食指和無名指對應患者腎經，拇指和小指置于胃經，腕關節帶動手掌指間關節在腹部進行頻率為300～400次/分鐘的振動[15]。振腹法操作腧穴主要為神闕穴，神闕穴位于臍中，是胎兒時期與母體相連的性命紐帶、神氣通行之門戶。走行于腹部的三陰經：足太陰脾經、足厥陰肝經、足少陰腎經，通過任脈、沖脈、帶脈與督脈將臍與陰陽諸經絡密切相聯系，故神闕穴為先后天神氣交匯出入之所，與人體氣血陰陽、臟腑功能盛衰虛實密切相關[16]。因此，振腹法通過神闕穴影響人體諸經脈，激發腎中之精氣，溫暖臟腑以驅散內寒，培元氣以溫胞宮、促天癸，調脾胃理中氣以生氣血，疏肝氣以理氣機，調理沖任，活血化瘀，從而達到治療作用。

研究表明，慢性炎癥參與了PCOS的發生發展過程[4]，PCOS患者無論有無肥胖，炎癥因子都存在不同程度的升高，其中以TNF-α、IL-6升高等為主[17]，這些炎癥因子與人體性激素水平含量密切相關。TNF-α可以刺激卵泡膜細胞增生，在調節卵泡期和黃體期卵巢的正常活動方面發揮重要作用[18]，且TNF-α參與PCOS患者的雄激素的代謝過程，與PCOS患者高雄激素血癥有關[19]。IL-6作為重要的促炎因子及免疫調節因子，在卵巢成熟和著床過程中起著重要作用[20-21]，且PCOS患者IL-6基因-174位點的G/C多態性與PCOS患病風險密切相關[22]。

本研究結果顯示，與模型組比較，對PCOS大鼠進行振腹法干預后，大鼠卵巢形態結構改善明顯，性激素LH、FSH、E2、T水平具有統計學差異，與二甲雙胍組同樣存在統計學差異，表明振腹法在改善PCOS大鼠性激素水平及卵泡生長發育情況方面具有一定療效，且療效較二甲雙胍顯著。此外，研究表明二甲雙胍對多種炎癥標志物產生影響，以TNF-α、IL-6為顯著[23]。本研究中振腹法干預可顯著降低PCOS大鼠炎癥因子TNF-α、IL-6水平，與二甲雙胍組比較無統計學差異，表明振腹法可調節PCOS大鼠炎癥反應且與二甲雙胍具有相同的療效。

因此，本研究結果提示改善慢性炎性狀態可能是振腹法治療PCOS的作用機制，為臨床振腹法治療PCOS提供了一定的科學依據。但本研究仍存在一些不足，本研究樣本量較少，研究結果可能存在統計學偏倚。此外本研究干預周期較短，振腹組與模型組大鼠比較炎性因子水平有顯著統計學差異，但與二甲雙胍組比較無明顯統計學差異，后期研究將加大樣本量并延長干預周期，進一步探討振腹法改善炎癥反應的作用機制。