龍牙楤木總皂苷及楤木皂苷A對缺氧/復氧誘導的AC16心肌細胞鐵死亡的影響

梁芳 魯衛星 周天琪 王胤博

經皮冠狀動脈介入治療、冠狀動脈旁路移植術等冠脈再通技術是把雙刃劍，在改善缺血的同時往往會造成心肌再灌注損傷，加重病情[1]。減輕血管再通后的心肌缺血再灌注損傷(myocardial ischemia/reperfusion injury, MIRI)成為臨床亟待解決的問題。研究表明，鐵死亡參與了MIRI的發生過程[2]，抑制鐵死亡可減輕MIRI[3]。細胞鐵死亡有可能成為心肌缺血再灌注新的治療靶點。

龍牙楤木為五加科楤木屬植物，其味辛、微苦，性平，具有益氣活血、止痛、祛風濕等功效。實驗研究發現，龍牙楤木總皂苷或其組分能通過減輕鈣超載、減輕氧化應激及炎癥反應等途徑減輕MIRI[4-6]，但其能否通過調節鐵死亡減輕MIRI仍不明確。因此，本研究通過觀察龍牙楤木總皂苷及其組分楤木皂苷A對缺氧/復氧AC16心肌細胞鐵死亡的影響，探討其是否能夠調控心肌細胞鐵死亡，并通過該機制緩解MIRI。

1 材料與方法

1.1 細胞及細胞培養

人AC16心肌細胞購自美國模式培養物集存庫(American Type Culture Collection，ATCC)。將細胞培養于含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 U/mL鏈霉素的DMEM培養基(完全培養液)中，在常氧培養箱(5%CO2、21%O2、74%N2)、37℃條件下培養，每1～2日換液一次。取生長良好的對數生長期細胞用于實驗。

1.2 實驗藥物

龍牙楤木總皂苷由吉林省中醫藥研究院提供，楤木皂苷A購自上海源葉生物公司(批號：B20219)，用二甲基亞楓溶解，以上藥物均分裝貯存于-80℃冰箱，取用時室溫溶解，用DMEM培養液釋至所需濃度。

1.3 主要實驗試劑

DMEM培養基購于美國Hyclone公司(貨號：SH30022.01)；胎牛血清購自美國Gibco公司(批號：1861242)；PBS緩沖液購于上海碧云天生物公司(貨號：C0221A)；CCK-8試劑盒購于同仁化學研究所(貨號：CK04)；LDH試劑盒購自上海碧云天生物公司(貨號：C0017)；鐵離子試劑盒購自北京普利萊基因技術公司(貨號：E1042)；MDA試劑盒(貨號：E-EL-0060c)、GSH試劑盒購于武漢伊萊瑞特公司(貨號：E-EL-0026c)；熒光探針-DHE購于南京凱基生物公司(貨號：KGAF019)；P53、SLC7A11、SAT1、GLS2抗體購于美國CST公司(貨號分別為2524S、12691S、61586S、ab113509)。

1.4 模型制備

將生長良好的人AC16心肌細胞換成缺氧培養液(氮氣預飽和過的無血清無糖DMEM)，并轉移至缺氧培養箱(94%N2、5%CO2、1%O2)，此過程為缺氧；缺氧完畢后，換成完全培養液并轉移至常氧培養箱中，此過程為復氧。將細胞分別缺氧12小時/復氧12小時、缺氧24小時/復氧12小時、缺氧48小時/復氧12小時處理，用CCK-8法測定細胞存活率，發現缺氧24小時/復氧12小時條件下細胞存活率下降至50%左右，提示此造模時間適合后續實驗，故選擇缺氧24小時/復氧12小時為造模時間。

1.5 分組及給藥

將AC16細胞分為正常組、模型組、龍牙楤木總皂苷組、楤木皂苷A組。正常組繼續使用完全培養液并置于常氧培養箱培養，不做其他處理；模型組按照上述模型制備方法，缺氧24小時/復氧12小時；龍牙楤木總皂苷組先給予濃度為0.1 mg/L的龍牙楤木總皂苷預處理6小時后，再進行缺氧24小時/復氧12小時處理；楤木皂苷A組先給予濃度為50 μg/mL的楤木總皂苷A預處理6小時后，再進行缺氧24小時/復氧12小時處理。(龍牙楤木總皂苷及楤木皂苷A濃度參照課題組前期實驗結果及相關文獻報道[7-8])。

1.6 指標檢測

1.6.1 CCK-8法檢測細胞存活率 將AC16心肌細胞接種于96孔板，分組處理后，每孔加入10 mL CCK-8溶液，孵育2～4小時，酶標儀測定450 nm波長處各孔吸光度值，計算細胞存活率。細胞存活率(%)=(實驗孔吸光度-空白孔吸光度)/(對照孔吸光度-空白孔吸光度)×100%，實驗重復3次。

1.6.2 乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase，LDH)試劑盒檢測LDH漏出率 LDH漏出率可反應心肌細胞損傷程度。檢測步驟：心肌細胞按分組進行不同處理后，將細胞培養板用多孔板離心機400 g離心5分鐘。盡量吸除上清，加入150 μL用PBS稀釋10倍的LDH釋放試劑，搖晃混勻，孵育1小時。隨后將細胞培養板400 g離心5分鐘。分別取各孔的上清液120 μL，加入到新的96孔板相應孔中。加入60 μL LDH檢測工作液，避光孵育30分鐘，酶標儀測定490 nm波長處各孔吸光度值。LDH漏出率(%)=(實驗孔吸光度-對照孔吸光度)/(空白孔吸光度-對照孔吸光度)×100%，實驗重復3次。

1.6.3 透射電鏡觀察細胞形態學變化 將AC16細胞按2×105個/孔密度接種于6孔板，經分組處理后，將其消化并吸收在PBS中。隨后用2.5%戊二醛固定2小時。按以下步驟制備：修整、制備半薄切片、定位、制備超薄切片及用鉛酸染色。最后，使用透射電鏡觀察并拍照。

1.6.4 鐵離子比色法試劑盒檢測胞內Fe2+水平 將AC16心肌細胞接種于24孔板，經分組處理后，去除培養基，用冷的PBS洗滌2次，將PBS吸棄。每孔加入200 μL裂解液裂解細胞，置于搖床裂解2小時后，加入200 μL混液A(按說明書配置)，混勻，60℃水孵育1小時，再加入30 μL鐵離子檢測劑，混勻，室溫孵育30分鐘，取上述混合液體200 μL于96孔板，在550 nm波長處測定吸光度，繪制標準曲線并計算鐵離子濃度，實驗重復6次。

1.6.5 DHE-熒光探針檢測活性氧(reactive oxygen species，ROS)水平 分組處理后按照使用說明，以DMSO溶解熒光探針DHE為5 mmol/L的儲存液，用無血清培養液稀釋儲存液至終濃度為5 μmol/L的工作液。去除細胞培養液，每孔加入1 mL稀釋好的工作液，37℃避光孵育20～30分鐘，用無血清細胞培養液洗滌細胞3次，以充分去除未進入細胞內的DHE。孵育后用新鮮培養液清洗細胞，用流式細胞儀觀察，實驗重復3次。

1.6.6 酶聯免疫吸附法檢測丙二醛(malondialdehyde，MDA)、谷胱甘肽(glutathione，GSH)水平 細胞經分組處理后，去除培養基，用冷的PBS洗滌1次，離心收集細胞，加入200 μL PBS重懸并通過反復冰融使細胞破碎，4℃下1 500 g離心10分鐘，取上清于96孔板。每孔加入150 μL GSH工作液或MDA工作液，室溫孵育5分鐘后加入50 μL終止液，酶標儀測定450 nm波長處各孔吸光度值，繪制標準曲線并計算GSH、MDA含量，實驗重復6次。

1.6.7 蛋白免疫印跡法檢測鐵死亡相關蛋白p53、SLC7A11、SAT1、GLS2的表達 分組處理后，收集各組心肌細胞加入適量PMSF裂解液于冰上裂解45分鐘，裂解完于4℃下12 000 r/min離心15分鐘，采用碧云天BCA法測定各組蛋白質濃度。將蛋白樣品與5×上樣緩沖液混合后于100℃處理5分鐘。通過丙烯酰胺凝膠電泳后轉移至PVDF膜上，5%脫脂奶粉封閉2小時，加入p53、SLC7A11、SAT1、GLS2抗體(1∶500)4℃孵育過夜，用TBST洗滌，二抗(1∶1000)37℃孵育2小時，TBST洗滌4次，用ECL化學發光發檢測各組蛋白表達水平，實驗重復3次。

1.7 數據處理

2 結果

2.1 龍牙楤木總皂苷及楤木皂苷A對缺氧/復氧損傷AC16細胞存活率及LDH漏出率的影響

與正常組相比，模型組細胞存活率明顯降低、LDH漏出率明顯升高(P<0.05)。與模型組相比，龍牙楤木總皂苷及楤木皂苷A預處理后細胞存活率明顯升高，LDH漏出率明顯降低(P<0.05)，且龍牙楤木總皂苷的作用更明顯(P<0.05)。見表1。

表1 龍牙楤木總皂苷及楤木皂苷A對AC16細胞存活率及LDH漏出率的影響

2.2 龍牙楤木總皂苷及楤木皂苷A對缺氧/復氧損傷后AC16細胞形態學的影響

透射電鏡下觀察細胞線粒體形態學變化是評價鐵死亡的關鍵標準。正常組細胞核呈橢圓形，胞質內線粒體呈短桿狀，結構完整、內嵴清晰，細胞表面可見少量突起。缺氧/復氧處理后，細胞核呈不規則狀，胞質內線粒體皺縮、內嵴粗厚、膜電子密度高，細胞表面可見少量突起。與模型組相比，經龍牙楤木總皂苷預處理后，細胞核呈橢圓形，胞質內線粒體體積稍小、內嵴大多清晰，細胞表面可見少量突起；而楤木皂苷A預處理后，細胞核稍不規則，胞質內線粒體輕微皺縮、內嵴稍厚、膜電子密度偏高，細胞表面可見少量突起。可見，經龍牙楤木總皂苷及楤木皂苷A處理后，可改善線粒體形態的損傷變化。見圖1。

注: N 細胞核；M 胞質內線粒體。

2.3 龍牙楤木總皂苷及楤木皂苷A對缺氧/復氧損傷后細胞內Fe2+、ROS、MDA、GSH水平的影響

與正常組相比，模型組細胞內Fe2+水平明顯升高(P<0.05)；與模型組相比，龍牙楤木總皂苷組和楤木總皂苷A組胞內Fe2+水平均顯著下降，且龍牙楤木總皂苷組下降更明顯(P<0.05)。見表2。

與正常組相比，模型組細胞ROS、MDA水平明顯升高，GSH水平降低(P<0.05)；與模型組相比，龍牙楤木總皂苷組及楤木總皂苷A組ROS、MDA水平下降，GSH水平升高，且龍牙楤木總皂苷的作用更明顯(P<0.05)。見表2、表3，圖2。

表2 龍牙楤木總皂苷及楤木皂苷A對缺氧/復氧損傷后胞內Fe2+、MDA、GSH水平的影響

表3 龍牙楤木總皂苷及楤木皂苷A對缺氧/復氧損傷后胞內ROS水平的影響

2.4 龍牙楤木總皂苷及楤木皂苷A對鐵死亡相關蛋白p53、SLC7A11、SAT1、GLS2表達的影響

與正常組相比，模型組損傷后p53、SAT1、GLS2蛋白表達水平升高，SLC7A11蛋白表達水平降低(P<0.05)；與模型組相比，龍牙楤木總皂苷組及楤木總皂苷A組p53、SAT1、GLS2蛋白表達水平明顯降低，SLC7A11蛋白表達明顯升高(P<0.05)；但龍牙楤木總皂苷組與楤木總皂苷A組之間無明顯差異(P>0.05)。見表4，圖3。

表4 龍牙楤木總皂苷及楤木皂苷A對鐵死亡相關蛋白p53、SLC7A11、SAT1、GLS2表達的影響

注: 橫坐標代表熒光強度，縱坐標代表細胞數目或比例；圖左上數字代表ROS陰性表達量，圖右上數字代表ROS陽性表達量。

圖3 各組缺氧/復氧損傷AC16細胞胞內鐵死亡相關蛋白p53、SLC7A11、SAT1、GLS2表達情況

3 討論

鐵死亡是與Fe2+過載及脂質過氧化損傷有關的新型細胞死亡方式，主要生化特征為Fe2+水平升高、ROS聚積、GSH合成下降、過氧化產物MDA堆積[9]。p53是一種抑癌基因，在調控細胞鐵死亡方面發揮了重要作用[10]。p53可通過抑制SLC7A11的表達，影響GSH合成，降低抗氧化能力，誘導鐵死亡[11]，或通過上調其某些靶基因如GLS2、SAT1，減少GSH合成、促進膜脂質過氧化，誘導鐵死亡[12-13]。

本課題組前期研究發現龍牙楤木總皂苷可通過提高GSH活力、增加超氧化物歧化酶活力、降低MDA水平，減輕氧化應激損傷，降低細胞凋亡相關蛋白Caspase-3、Bax的表達，發揮抗大鼠心肌缺血再灌注損傷的作用[14-16]。本實驗在前期研究的基礎上，進一步從細胞鐵死亡角度探討龍牙楤木總皂苷抗心肌缺血再灌注損傷的作用機制。

研究結果表明，龍牙楤木中皂苷及其組分楤木皂苷A能夠降低缺氧/復氧后AC16心肌細胞內Fe2+水平、增加GSH活力、降低ROS、MDA水平，并降低鐵死亡相關蛋白p53、GLS2、SAT1的蛋白表達、上調SLC7A11的蛋白表達。上述結果提示龍牙楤木總皂苷及其組分楤木皂苷A可減輕缺氧/復氧過程中的鐵離子過載及過氧化損傷，抑制細胞鐵死亡，保護心肌細胞。其機制可能與抑制p53、GLS2、SAT1的表達及上調SLC7A11表達有關，具體機制有待進一步明確。