健脾止動湯對慢性束縛應激抽動障礙大鼠前額葉皮質神經元及神經營養因子的影響

白雪 張宏賢 周倩倩 馬寧 閆文宏 張晶晶 崔霞

抽動障礙是兒童時期常見的一種慢性神經精神障礙性疾病。在中國，學齡期兒童抽動障礙的患病率已達到6.1%，近年來其患病率呈明顯上升趨勢[1]。中藥因其較好的療效和安全性在抽動障礙的治療方面發揮著積極的作用。健脾止動湯是國家名老中醫藥專家王素梅教授的經驗處方，在臨床上取得了確切的療效[2]，于2015年獲得國家專利(專利號：CN201510198368.8)。

抽動障礙屬于神經發育障礙性疾病，其發生可能與神經元的生長及分化、突觸的生長及修剪等有關。課題組前期發現抽動障礙存在谷氨酸系統功能亢進[3]，而谷氨酸的高表達在腦發育的后期或病理狀態下表現為神經毒性，對神經元存在較強的破壞性，而神經營養因子在神經發育中起著重要作用[4]。故本研究采用IDPN腹腔注射聯合慢性束縛應激因素制備慢性束縛應激抽動障礙大鼠模型[5]，觀察健脾止動湯對模型大鼠前額葉皮質區神經元及神經營養因子水平的影響，為進一步研究健脾止動湯治療抽動障礙的作用機制提供研究基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及實驗環境

健康離乳3周齡雄性SD大鼠48只，體質量40～60 g，SPF級，由北京維通利華實驗動物技術有限公司提供，動物許可證號：SCXK(京)2016-0006。分籠適應性飼養5天，自由飲食，溫度(22±2)℃，相對濕度40～70%，于中日友好醫院臨床醫學研究所實驗動物中心飼養。

1.2 實驗藥物

健脾止動湯配方顆粒(太子參10 g、鉤藤10 g、茯苓10 g、炒白術10 g、半夏6 g、陳皮6 g、川芎6 g、龍膽草3 g、當歸10 g、防風6 g，購自北京中醫藥大學第三附屬醫院顆粒藥房，由北京康仁堂藥業有限公司提供)，配成溶液(1 mL藥液中約含1.6 g生藥)，4℃冰箱存用；鹽酸硫必利片(泰必利，規格：100 mg，江蘇恩華藥業股份有限公司，批號：20191208)，用生理鹽水配成混懸液(1 mL藥液中約含有2.1 mg原藥)。

1.3 主要實驗試劑與儀器

IDPN[西格瑪奧德里奇(上海)貿易有限公司，貨號：317306]；大鼠腦源性神經營養因子(Rat BDNF)酶聯免疫試劑盒(批號：20200719.60239R)、大鼠神經生長因子(Rat NGF)酶聯免疫試劑盒(批號：20200719.60150R)、大鼠胰島素樣生長因子-1(Rat IGF-1)酶聯免疫試劑盒(批號：20200719.60059R)，總蛋白試劑盒(批號：20211230.30002)，均購于北京瑞格博科技發展有限公司。尼氏(Nissl)染液(甲苯胺藍法)(上海源葉生物科技有限公司，貨號：R30434)；Unicel DxC 600 Synchron 全自動生化分析儀(美國Beckmancoulter)。

1.4 動物分組及造模

SD大鼠適應性喂養5天后，按體質量隨機分為空白組12只和造模組36只。空白組予腹腔注射生理鹽水1 mL/(100 g·d)，每日1次，連續7天；造模組予腹腔注射IDPN[250 mg/kg，1 mL/(100 g·d)]，每日1次，連續7天。同時予慢性束縛法造模，將大鼠放置于束縛裝置中，每日連續束縛3小時(8:00-11:00 am)，連續21天。束縛期間造模組及空白組大鼠均禁食水。第22天進行刻板運動、曠場實驗等行為學檢測，造模組表現出嚙齒類動物刻板行為的典型特征，如旋轉運動、頭部垂直或水平方向運動，表示模型誘導成功。根據刻板運動評分及曠場實驗評分結果，將造模成功的模型大鼠隨機分為模型組、硫必利組、健脾止動湯組各12只。

1.5 給藥方法

造模第23天開始給藥，空白組及模型組予生理鹽水灌胃，硫必利組予鹽酸硫必利混懸液灌胃(1 mL藥液中約含2.1 mg原藥)，健脾止動湯組予健脾止動湯溶液灌胃(1 mL藥液中約含1.6 g生藥)，均按1 mL/(100 g·d)灌胃，每日1次，連續4周。

1.6 指標檢測

末次用藥后，每組各隨機選取5只大鼠斷頭取腦，4%多聚甲醛固定，脫水，常規石蠟包埋，制成6 μm的石蠟切片，進行尼氏染色。利用Lecia圖文分析系統在高倍顯微鏡下觀察皮質區神經元細胞及尼氏小體形態結構及數目的變化。

末次用藥后，每組各隨機選取7只大鼠斷頭取腦，在冰盒上迅速剝離大鼠前額葉皮質，置于凍存管中，液氮凍存后，存放于-80℃冰箱中，以待檢測。嚴格按照ELISA試劑盒說明書進行檢測，用酶標儀以450 nm波長檢測其吸光度值。

1.7 統計學處理

2 結果

2.1 健脾止動湯對慢性束縛應激抽動障礙大鼠前額葉皮質區神經元尼氏小體的影響

尼氏染色結果顯示，空白組前額葉皮質區神經元結構正常，排列緊密，胞漿中尼氏小體豐富，可見藍紫色斑塊狀尼氏小體。與空白組相比，模型組神經元排列稀疏，細胞間隙增大，胞漿內尼氏小體表達減弱，顏色變淺，部分明顯溶解、消失，數量明顯減少(P<0.05)；與模型組相比，硫必利組神經元排列相對緊密，細胞間隙略減少，胞漿內尼氏小體表達略增強，顏色稍有加深，數量略增多(P>0.05)，健脾止動湯組神經元排列緊密，細胞間隙減小，胞漿內尼氏小體表達豐富，顏色加深，數量明顯增多(P<0.05)。見圖1、表1。

圖1 各組慢性束縛應激抽動障礙大鼠前額葉皮質神經元尼氏小體表達情況(尼氏染色，×400)

表1 各組慢性束縛應激抽動障礙大鼠前額葉皮質神經元尼氏小體表達情況

2.2 健脾止動湯對慢性束縛應激抽動障礙大鼠前額葉皮質區神經營養因子的影響

與空白組大鼠相比，模型組大鼠皮質中腦源性神經營養因子(brain-derived neurotrophic factor，BDNF)含量有下降趨勢，但差異無統計學意義(P>0.05)；與模型組相比，硫必利組大鼠皮質中BDNF含量有升高趨勢，但差異無統計學意義(P>0.05)，健脾止動湯組大鼠皮質中BDNF含量顯著升高(P<0.05)。與空白組相比，模型組大鼠皮質中胰島素樣生長因子-1(insulin-like growth factor-1，IGF-1)含量顯著降低(P<0.05)；與模型組相比，硫必利組、健脾止動湯組大鼠皮質中IGF-1含量顯著升高(P<0.05)。與空白組相比，模型組大鼠皮質中神經生長因子(nerve growth factor，NGF)含量升高，但差異無統計學意義(P>0.05)；與模型組相比，健脾止動湯組大鼠皮質中NGF含量顯著升高(P<0.05)。見表2。

表2 各組慢性束縛應激抽動障礙大鼠前額葉皮質神經營養因子表達情況

3 討論

抽動障礙在中醫古籍中沒有相應的病名，但根據其癥狀特點，可歸于“肝風”“瘛瘲”“慢驚風”的范疇。健脾止動湯是王素梅教授的經驗用方。王教授認為抽動障礙的主要病機為脾虛肝亢、風痰內擾,結合小兒“肝常有余、脾常不足”的生理特點及五行生克理論，認為“土衰則木橫，木橫則土益衰”，土虛不能制約肝木，土虛風動，出現運動性抽動的癥狀，肝風夾痰上擾可見發聲性抽動的表現。因此采用扶土抑木之法，健脾平肝，由六君子湯合瀉青丸加減化裁，創立健脾止動湯。取六君子湯健脾益氣、燥濕化痰，達到實脾以抑肝木之效；用瀉青丸清肝瀉火，以平抑肝風；二者合用以達到扶土抑木之功。肝與先天腎為肝腎同源關系，以藏瀉互用為前提，肝疏泄功能正常，腎精充足才能充髓養腦；且肝脈絡于腦。而脾為氣血生化之源，可升清陽上達以榮腦。前期研究發現健脾止動湯可以改善患兒抽動癥狀，提高患兒血清中BDNF含量[6]，同時也可改善慢性束縛應激抽動障礙大鼠的刻板行為及學習記憶能力[7]。

目前神經解剖與功能影像學研究顯示，抽動障礙的發病與大腦皮質—基底節—丘腦—皮質神經環路的結構與功能發育異常相關，前額葉皮質是其重要環節[8-9]。臨床研究顯示抽動障礙患兒存在前額葉皮質厚度變薄[10-11]，通過前額葉局部的經顱磁治療可用于本病的治療[12]。尼氏小體是由神經元胞質內發達的粗面內質網和分布其間的游離核糖體構成，用于合成更新細胞器所需的結構蛋白、合成神經遞質所需的酶類以及神經肽[13]。當尼氏小體正逐步減少甚至消失時，說明神經細胞在遭受損傷。尼氏染色結果顯示，與空白組相比，模型組大鼠均可見前額葉皮質區尼氏小體顯著減少；與模型組相比，健脾止動湯組尼氏小體表達顯著增多，提示模型組大鼠存在前額葉皮質的神經元損傷，健脾止動湯具有保護大鼠前額葉皮質神經元的功能。

神經營養因子能支持和調控神經組織的生長發育，對受損區域的神經元及其附屬結構起到保護和修復作用。BDNF是體內含量最多的神經營養因子，廣泛參與大腦的調節功能，包括運動、學習和記憶等。生物遺傳學和心理學研究發現[14]，BDNF Val66Met多態性是我國漢族人群抽動障礙的常見遺傳易感性，同時臨床發現[15]較低濃度的血清BDNF多提示抽動障礙患兒遠期預后效果較差。BDNF與其受體肌球蛋白相關激酶B結合，引起受體磷酸化，進而激活神經元的下游細胞內信號，抑制皮質區多巴胺能神經元中谷氨酸引起的神經毒性[16]。本研究結果顯示健脾止動湯組大鼠前額葉皮質BDNF較其他組升高，與課題組前期研究健脾止動湯可提高抽動障礙患兒血清中BDNF水平的結論相一致[6]。

IGF-1是一類具有類胰島素樣作用的生長因子、非選擇性神經營養因子，參與情緒的控制與調節。在神經系統中大腦皮層、海馬等區域可檢測到高水平的IGF-1[17]，而循環系統中70～90%的IGF-1由肝臟合成和分泌，受生長激素體調節，可通過血腦屏障進入神經系統[18]。當神經元受損后腦組織需要大量的IGF-1，大量外周血中的IGF-1可通過血腦屏障進入腦組織。研究發現IGF-1有促進多巴胺能神經元細胞存活和增值的能力[17]。運動神經障礙患者的腦脊液中IGF-1水平較健康對照組明顯降低[19]，而外源性IGF-1可降低抽動大鼠紋狀體內氨基酸遞質水平及凋亡蛋白的表達[20]。本研究結果提示模型組大鼠存在IGF-1分泌不足，而健脾止動湯可促進模型鼠前額葉皮質IGF-1的表達。

NGF是最早發現的細胞生長調節因子，是交感神經元和感覺神經元的生長和存活所必須的。血腦屏障對NGF具有選擇性通透作用，發生腦損傷時，NGF更容易透過血腦屏障，進入腦組織中[21]。葛莉等[22]通過臨床分析130例抽動障礙患兒的血清NGF水平，發現患兒血清中NGF水平升高，且與病情嚴重程度密切相關。而NGF及其受體在應激相關的情緒障礙的發病機制中起著關鍵作用[23]，慢性應激暴露可導致大鼠前額葉皮質NGF水平顯著下降[24]。本研究結果顯示模型組前額葉皮質NGF水平與空白組無明顯差異，與相關報道不一致。推測原因可能與慢性束縛應激的暴露降低了抽動障礙大鼠前額葉皮質NGF含量；也可能與慢性束縛應激抽動障礙大鼠存在5-羥色胺水平升高有關[5]，因5-羥色胺可上調NGF的水平[25]。

本研究的局限性在于僅采用Elisa法對大鼠前額葉皮質中相關神經營養因子的含量進行測定，方法較為單一，且未對相關神經營養因子的不同活化形式及受體進行測定，樣本量較小。后期需增加樣本量，采用不同檢測方法，更加深入地研究其具體作用機制。

本研究初步驗證了健脾止動湯可提高大腦皮質神經營養因子的表達，從而降低模型組大鼠神經元的損傷，揭示了健脾止動湯可能是通過調節神經營養因子在前額葉的表達，減輕神經元損傷，起到神經保護作用，從而發揮抗抽動效應。