不同釀酒酵母菌發酵樹莓果酒的理化特性

趙文英，薛 穎，花 錦，張志瑞，王 蓉，楊潤璐，王立敏

（1.中北大學化學工程與技術學院，山西太原 030051；2.中華人民共和國太原海關，山西太原 030001）

樹莓是薔薇科懸鉤子屬的一種落葉灌木的聚合漿果。樹莓富含多種抗氧化活性成分，被譽為“第三代黃金水果”[1-2]。樹莓果酒顏色艷麗、香氣濃郁、口感獨特，作為一種新型的健康商業飲品正在興起[3]。

釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）是果酒酒精發酵的主導微生物[4-5]。在發酵過程中，釀酒酵母的生長代謝會引起果酒中各種物質組分的變化，從而影響著果酒的品質[6-9]。樹莓中有機酸含量高，且檸檬酸比重大，導致紅樹莓果酒產品口感不佳。生物降酸是指微生物以有機酸為碳源，利用并分解，從而達到降酸目的。在果酒釀造中，通常采用蘋果酸乳酸發酵法來降酸，但不能對檸檬酸起到降酸效果。有研究表明，有些釀酒酵母菌可以通過相關代謝降解有機酸[8]。陳思睿等[10-11]對紅樹莓果園土壤和鮮果上的微生物進行分離純化，篩選出具有較強降解檸檬酸能力的菌株，這些菌株經鑒定均屬于非釀酒酵母，其被推薦應用于紅樹莓果汁的降酸處理。目前，商業釀酒酵母對樹莓有機酸組成影響的研究較少。

樹莓果酒中的酚類物質在感官質量、抗氧化活性等方面發揮著重要影響[12-13]，它可分為花色苷酚和非花色苷酚[13]。樹莓果酒的一個重要特點是顏色靚麗，但在存貯過程中，顏色容易加深褐化。果酒的視覺特性主要是由花色苷酚引起的，但花色苷酚與非花色苷酚類物質的相互作用對視覺的影響更為重要[14-16]。另外，非花色苷酚還會對果酒口感特征也產生重要影響[14]。

以往樹莓果酒釀酒酵母的篩選研究多集中在理化指標、抗氧化活性、香氣分析上[11-12，17-18]，對有機酸和非花色苷酚物質影響的研究報道較少。該實驗采用山西地區的秋福樹莓凍果為原料，考察了5種商業釀酒酵母對樹莓果酒發酵曲線、理化指標、有機酸組分及非花色苷單體酚組分及感官指標的影響，以篩選出能體現樹莓原料特征的釀酒酵母。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

秋福樹莓：2020年9月在山西省繁峙縣大木瓜村采集（成熟度超過80%）；釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）CECA、BV818：湖北安琪酵母股份有限公司；釀酒酵母71B：煙臺帝伯仕貿易有限公司；釀酒酵母VP5、Montrachet：意大利VASON公司Color果膠酶（酶活30 000 U/g）：德國AB酶試劑公司。

有機酸的標準物：草酸、酒石酸、蘋果酸、抗壞血酸、乳酸、醋酸、檸檬酸、琥珀酸（均為色譜純）；單體酚的標準物：原花青素、香草酸、水楊酸、鞣花酸、沒食子酸、綠原酸、咖啡酸、兒茶素、表兒茶素、蘆丁、山奈酚、槲皮素標準品（均為色譜純）；上海安譜實驗科技有限公司；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-trinitrophenyl，DPPH）：美國Sigma公司。

1.2 儀器與設備

LC-1260Ⅱ型高效液相色譜儀：美國安捷倫科技公司；Innoval ASB C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）和NH2色譜柱（9 mm×250 mm，4.6 μm）：美國色譜科公司；QTRAP 4500 LC/MS液相色譜質譜聯用儀：美國AB SCIEX公司；Thermo Hypersil GOLD C18液相色譜柱（2.1 mm×50 mm，1.8 μm）：美國熱電公司；WGZ-200濁度儀：上海儀電物理光學儀器有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 樹莓果酒的釀制

樹莓凍果自然解凍后，加入保護劑偏重亞硫酸氫鉀（30 mg/L）破碎；加入Color果膠酶30 mg/kg，在50 ℃條件下進行酶解1.5 h，每30 min攪拌一次；酶解浸漬結束后，迅速降溫，并壓榨出汁；在4～5 ℃條件下，靜置沉淀24 h后，將清汁分離，測清汁的酸度、糖度、pH；配制碳酸氫鉀母液（100 g/L），調節pH至3.2；加入葡萄糖，調整起始糖度為21 °Bx。均質化后的果汁分裝到5 L玻璃瓶中，控制溫度于15～18 ℃儲藏。活化商業酵母（VP5、Montrachet、71B、BV818、CECA）按200 mg/L接種，并加入200 mg/L營養劑，啟動發酵；每天監測兩次pH、糖度、溫度；待發酵徹底結束，倒罐，加入50 mg/L的偏重亞硫酸氫鉀，密閉低溫陳釀三個月后取樣檢測，期間倒罐一次。

1.3.2 發酵曲線繪制

發酵曲線是用來表示微生物發酵過程的動態情況，每12 h測一次糖度，以發酵時間為橫坐標，以果酒糖度為縱坐標，繪制發酵曲線。

1.3.3 理化指標的測定

pH、可滴定酸、殘糖等指標的測定參考GB/T 15038—2006《葡萄酒果酒分析方法》；乙醇含量的測定參考文獻[5]；色度以酒樣在波長420 nm、520 nm、620 nm處吸光度值加和來表示；濁度使用WGZ-200濁度儀測定；總酚含量采用Folin酚比色法測定，結果以mg沒食子酸當量（gallic acid equivalent，GAE）/L表示[19]；DPPH自由基清除率的測定參考文獻[19]；糖度用手持糖度計測定。

1.3.4 高效液相色譜測定有機酸和甘油

酒樣品8 000×g離心5 min后，用0.22 μm濾膜過濾后進行分析。采用Innoval ASB C18色譜柱分離有機酸，流動相為0.1 mol/L H3PO4，流速1.0 mL/min，總運行時間7 min，紫外-可見光譜檢測波長214 nm。

甘油測定采用NH2柱（9 mm×250 mm，4.6 μm），使用流動相為乙腈∶水（85∶15，V/V），流速為1.0 mL/min，采用RI-II檢測器進行檢測。樣品需用流動相稀釋10倍。樣品進行3次平行測定[20]。

1.3.5 高效液相色譜-質譜測定非花色苷單體酚

10 mL樹莓果酒樣品分別在pH 7.0和pH 2.0條件下用120 mL乙酸乙酯分六次提取。提取液混合后，采用真空旋轉蒸發器上蒸發干燥，溫度設置35 ℃。干殘渣用10 mL甲醇溶解后，通過0.22 μm有機膜過濾后進入高效液相色譜-質譜系統。色譜柱為Thermo Hypersil GOLD C18（50 mm×2.1 mm，1.8 μm），進樣量為5 μL。流動相A、B分別為0.1%甲酸水和乙腈，流速為0.30 mL/min。單體酚分離梯度程序為0 min，5%；0.5 min，5%；2 min，95%；4 min，95%；1 min，5%；5 min，5%。采用電噴霧離子源（electrospray ionization，ESI）負離子模式對12種單體酚進行了質譜分析。毛細管源溫度為600 ℃，護套氣體流量為60 m3/h，輔助氣體流量為10 m3/h，噴霧電壓設置為5 500 V。光譜在100～1 000 m/z全掃描模式下獲得。使用標準溶液在6種不同濃度下的峰面積校準曲線計算出所有單體酚的含量，并以μg/L表示[21]。

1.3.6 樹莓果酒感官質量評分

感官指標主要是通過視覺、嗅覺、味覺、觸覺對酒樣進行感官評價，包括顏色、香氣、滋味、口感、典型性5個方面[18]。每個指標得分以10分計，得分標準：極端不舒服（1分）；非常不舒服（2分）；中度不舒服（3分）；輕微不舒服（4分）；無好無壞（5分）；輕微舒服（6分）；中度舒服（7分）；非常舒服（8分）；極度舒服（9分）；完美（10分）；由學院20名具有專業知識的人員，對酒樣進行感官評分。對應感官評價得分以平均值計，滿分50分。

1.3.7 實驗數理統計分析

所有的試驗均做3次重復，結果表示為“平均值±標準差”（n=3）。所有數據均采用IBM SPSS version 26.0進行統計分析。使用Origin8.0軟件進行圖表繪制。

2 結果與分析

2.1 不同釀酒酵母菌的發酵曲線

不同釀酒酵母菌的發酵曲線可反映出酵母菌的啟動、發酵速率和發酵周期情況，是衡量酵母發酵能力的重要方法[4]。整個發酵實驗保持15～18 ℃低溫環境下進行，不同釀酒酵母菌的發酵曲線圖見圖1。

圖1 不同釀酒酵母菌的發酵曲線Fig.1 Fermentation curves of different Saccharomyces cerevisiae strains

由圖1可知，釀酒酵母CECA和71B耐受性強，發酵啟動快速，24 h后進入旺盛發酵期，發酵速率快且發酵周期短；菌株CECA通常用于紅葡萄酒的釀造，發酵能力強，菌株71B為降酸酵母。菌株Montrachet與BV818發酵的酒樣啟動快速，24 h后開始進入旺盛發酵期，后期發酵速率緩和有力，發酵徹底，發酵周期適中；這兩菌株通常為白葡萄酒推薦使用菌株。從后期成品酒的感官評分看，更適合樹莓果酒發酵。而且，菌株Montrachet被認為是一種非常好的適合大多數水果使用的釀酒酵母[4]。菌株VP5啟動最為緩慢，72 h后進入旺盛發酵期，180 h后發酵結束，發酵周期最長。

2.2 不同酵母對樹莓果酒發酵基礎指標的影響

2.2.1 理化指標分析

五株釀酒酵母發酵所得樹莓果酒的理化指標見表1。由表1可知，不同釀酒酵母在pH、可滴定酸、殘糖、酒精度等方面都存在顯著性差異（P＜0.05）。菌株71B和Montrachet發酵的酒樣pH高于其他菌株，菌株71B是用于葡萄酒降酸的釀酒酵母，但在樹莓果酒中，并沒有表現出明顯的降酸優勢，可能與兩者有機酸組成組分不同有關，而Montrachet的降酸能力卻值得進一步分析。所有酒樣的殘糖含量都＞4 g/L，其中殘糖量最大、酒精度較低的是菌株BV818，說明樹莓果汁的低酸環境對BV818的發酵能力有一定影響，而殘糖較低、酒精度較高的是菌株Montrachet和CECA。同時，菌株Montrachet具有較強的產甘油的能力，其甘油含量最高，為8.22 g/L，顯著高于其他四個酒樣（P＜0.05）。甘油是果酒釀造中一種非常重要的副產物，具甜味和油性的感官特性，對于平衡果酒風味具有重要作用，低溫、高酸的發酵條件有利于酵母菌在發酵過程中生成甘油[4]。從總酚和抗氧化性的角度看，菌株Montrachet發酵的酒樣與菌株71B、CECA發酵的酒樣無顯著差異（P＞0.05），均表現出較高的總酚含量和抗氧化活性。總酚檢測結果與文獻報道的樹莓總酚范圍1.5～3.0 g/L相符[21]。菌株VP5的總酚含量和抗氧化活性均顯著低于其他菌株（P＜0.05），可能與其酒泥凝聚沉淀能力強有關。從上述理化指標分析結果來看，菌株Montrachet在發酵樹莓果酒的過程中表現最佳，具有一定的降酸能力，發酵徹底，酒精度高，且具有較強的甘油生產能力，其總酚含量和抗氧化活性高。

表1 不同釀酒酵母菌樹莓果酒的理化指標Table 1 Physicochemical indexes of raspberry wine fermented by different Saccharomyces cerevisiae strains

2.2.2 有機酸比較

有機酸的含量在一定程度上影響著葡萄酒的風味平衡、化學穩定性、pH值，從而影響著果酒的質量[23]。不同釀酒酵母樹莓果酒中的部分有機酸含量測定結果見表2。

由表2可知，樹莓果酒中最主要的有機酸是檸檬酸，約占總酸含量的90%；其次是蘋果酸、乳酸、抗壞血酸、酒石酸等，酒樣中未檢出琥珀酸，測定結果與PONDER A等[1]的檢測結果（檸檬酸17.2 g/L，蘋果酸0.46 g/L）接近。發酵能力最強的菌株CECA發酵酒樣總酸值最大，檸檬酸占比最高，且菌株CECA代謝會造成蘋果酸、乳酸、醋酸含量顯著升高（P＜0.05）。適合白葡萄酒釀造的菌株BV818和Montrachet發酵所得酒樣總酸值較小，且蘋果酸含量顯著低于其他3個樣品（P＜0.05），所有樣品的酒石酸含量無顯著差異（P＞0.05）。MENA P等[22]報道了石榴酒發酵過程中有機酸的變化，研究發現檸檬酸和酒石酸含量沒有變化，而蘋果酸在釀造過程中顯著增加。王博[24]在優選藍莓釀酒酵母時，分析了四種釀酒酵母對藍莓果酒有機酸的動態影響，發現檸檬酸在發酵過程中降低幅度最大，使得成品藍莓酒中基本檢測不出檸檬酸，而蘋果酸含量卻大幅增加，為起始含量的4倍。菌株Montrachet發酵酒樣發酵速率平緩，總酸值最少，檸檬酸和蘋果酸含量最低。在保持酒樣糖酸平衡方面，具有明顯優勢。

表2 不同釀酒酵母菌樹莓果酒中的有機酸成分Table 2 Organic acid ingredient of raspberry wine fermented by different Saccharomyces cerevisiae strains

2.2.3 不同釀酒酵母菌樹莓果酒中單體酚含量比較

果酒中的非花色苷酚類物質在感官品質、抗氧化活性等方面發揮著重要影響[13]，不同釀酒酵母樹莓果酒中單體酚的含量測定結果見表3。

表3 不同釀酒酵母菌樹莓果酒中單體酚的含量Table 3 Mono-phenol contents of raspberry wine fermented by different Saccharomyces cerevisiae strains

結果表明，該研究共定量檢測了樹莓酒中11種非花色苷單體酚，各酒樣中槲皮素含量最高，其次是鞣花酸、沒食子酸、兒茶素、表兒茶素等。從各類單體酚的總量來看，酚酸類約占總含量的50.2%，黃酮醇類32.5%，黃烷醇類17.3%。JELENA J等[25]通過高效液相色譜法測定樹莓多酚的檢測結果顯示，表兒茶素含量最高。郭雪[13]提出樹莓果肉中最豐富的非花色苷酚是黃酮醇類和酚酸類。YANG J等[21]認為鞣花酸單寧是樹莓中含量較高的重要功能成分，這與本研究檢測結果基本保持一致。

從酚酸總值看，菌株BV818和Montrachet發酵的酒樣中含量最高，其中鞣花酸和沒食子酸含量顯著高于其他樣品（P＜0.05）。在低溫環境下，這兩菌株的發酵速率平緩，可能有利于小分子酚酸物質的溶出。有研究表明，這些小分子酚酸物質具有較強的輔色能力，因為能保護花青素在黃酮離子的C2位置不被親核分子攻擊，從而促進更高的顏色穩定性[28]。ZHANG X K等[29]提出酚酸類中的鞣花酸與沒食子酸對果酒的花色苷有護色、增強穩定性的作用。

黃烷醇類是樹莓果酒苦澀味的物質基礎，能夠影響到果酒的口感[14，27]。由表3可知，發酵力強的菌株CECA和71B具有較強的黃烷醇類物質的浸提能力。而菌株Montrachet和BV818發酵的樣品中黃烷醇類含量居中。這也可能是Montrachet和BV818酒樣由于適當的黃烷醇含量，而在感官品評中能獲得較高分值的一個原因。而VP5黃烷醇類物質含量最小，不利于形成豐富的口感，從而會影響感官評分。非花色素苷酚中的黃酮類物質無明顯規律性變化，其含量主要影響樹莓酒的顏色[14]。

從總體上看，釀酒酵母Montrachet在低溫發酵過程中，能整體提升酒樣中酚類物質的含量，顯著促進了鞣花酸和沒食子酸的釋放，增強了護色作用，并弱化黃烷醇類物質的提取，減少了苦澀感。

2.3 不同釀酒酵母菌樹莓果酒的感官評價

由實驗室成員組成評定小組，對五種釀酒酵母發酵所得的果酒樣品進行感官評定，評價結果見圖2。由圖2可知，由五種釀酒酵母發酵獲得的樹莓果酒在果酒顏色方面，Montrachet和BV818酒樣顏色鮮艷。但在香氣、滋味、口感和典型性方面，Montrachet酒樣評分都最高。Montrachet酒樣澄清透亮、香氣自然舒適、滋味均衡豐富，酒體圓潤并具有一定的結構感，但沒有強烈的酸澀感，保持了良好的樹莓酒風格的典型性。

圖2 不同釀酒酵母樹莓果酒的感官評價Fig.2 Sensory evaluation of raspberry wine fermented by different Saccharomyces cerevisiae strains

3 結論

該研究以秋福樹莓為原料，選用5種不同釀酒酵母發酵制備樹莓果酒。結果表明，菌株VP5啟動最為緩慢，71B無明顯降酸效果，CECA和BV818感官評分略低，而酵母菌株Montrachet發酵樹莓汁啟動快速，發酵速率平緩，發酵徹底。所得酒樣可滴定酸低，乙醇含量高，殘糖量低，甘油含量高，且具有高的總酚含量及抗氧化活性。從有機酸分析結果看，釀酒酵母Montrachet具有較強的降低檸檬酸和蘋果酸的能力。從非花色苷單體酚檢測結果看，釀酒酵母Montrachet酒樣非花色苷總酚含量最高，其中鞣花酸、沒食子酸等酚酸物質含量高，有助于保護樹莓果酒靚麗的色澤；而黃烷醇酚物質含量居中，可避免強烈的苦澀感。故釀酒酵母Montrachet是適合樹莓果酒釀造的優良菌株。