基于Illumina MiSeq高通量測序技術解析利川醬豆真菌多樣性

董 蘊，張苗苗，鄧子文，劇 檸，郭 壯，趙慧君

（1.湖北文理學院 湖北省食品配料工程技術研究中心，湖北 襄陽 441053；2.寧夏大學 食品與葡萄酒學院，寧夏 銀川 750021）

發酵豆制品是以各種豆類為原料，在開放環境中經自然發酵而形成特色風味的發酵成品[1]。醬豆作為我國主要的傳統發酵豆制品之一，在發酵的過程中受微生物作用產生獨特的風味，發酵后的豆制品營養豐富，容易被人體消化吸收[2-4]。在我國，醬豆的食用歷史比較悠久，深受廣大消費者的喜愛，其作為發酵豆制品具有抑制腫瘤生長、降血壓、降血脂、延緩衰老和抗氧化等功效[4-6]。由于醬豆相對開放的發酵環境，導致其在發酵過程中的微生物菌群組成豐富且較為復雜，由于醬豆中所含的微生物對產品的風味造成影響，因此對醬豆中的微生物進行解析顯得尤為重要。JUNG J Y等[7]利用焦磷酸測序技術研究韓國發酵豆醬中醬醅的微生物動態變化，結果發現，發酵豆醬中醬醅的優勢細菌和真菌分別為芽孢桿菌（Bacillus）和毛霉（Mucor）；張穎等[8]利用聚合酶鏈式反應-變性梯度凝膠電泳（polymerase chain reaction-denaturing gradient gel electrophoresis，PCR-DGGE）結合高通量測序技術對東北傳統自然發酵豆醬發酵過程中的細菌多樣性進行研究，結果發現，不同發酵階段豆醬的優勢細菌屬為乳桿菌屬（Lactobacillus）、明串珠菌屬（Leukonostoc）、四聯球菌屬（Tetragenococcus）和腸球菌屬（Enterococcus）；安飛宇等[9]對發酵豆醬的微生物多樣性進行了解析，結果發現豆醬中的優勢細菌屬為乳桿菌屬和四聯球菌屬，優勢真菌屬為青霉菌屬（Penicillium）和異常威克漢姆酵母屬（Wickerhamomyces）。

高通量測序技術是分析食品中微生物多樣性的方法之一，其通量高，測序結果準確，能夠產生大量的有用信息[10-12]。目前，高通量測序技術已經廣泛應用于醫學[13-14]、植物[15-16]以及食品[17-19]等諸多領域，其中在分析食品中微生物的多樣性研究中應用尤為廣泛。高世南等[20]采用Illumina MiSeq高通量測序技術對新疆新源縣酸馬奶的細菌多樣性進行了解析，結果顯示酸馬奶中的優勢細菌門主要為厚壁菌門（Firmicutes），優勢細菌屬主要為乳桿菌屬（Lactobacillus）。

本研究以湖北省恩施土家族苗族自治州利川市的醬豆為研究對象，利用Illumina MiSeq高通量測序技術對其中的真菌多樣性和群落結構進行解析，以期為后續醬豆的工業化生產提供數據和理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

采集自湖北省恩施土家族苗族自治州利川市集市上10個不同攤位的醬豆樣品，樣品編號依次為LCJM1、LCJM2、LCJM3、LCJM4、LCJM5、LCJM6、LCJM7、LCJM8、LCJM9和LCJM10。

1.1.2 試劑

QIAGEN DNeasy maricon Food Kit脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）基因組提取試劑盒：德國QIAGEN公司；FastPfuFlyDNAPolymerase、5×TransStartTM、脫氧核糖核苷三磷酸（deoxy-ribonucleoside triphosphate，dNTPs）Mix：北京全式金生物技術有限公司；111860瓊脂糖：香港基因有限公司；其他試劑均為國產分析純。

1.2 儀器與設備

2100芯片生物分析儀：美國Agilent公司；Vetiri梯度基因擴增儀：美國AB公司；5810R臺式高速冷凍離心機：德國Eppendorf公司；UVPCDS8000凝膠成像分析系統：美國BIO-RAD公司；ND-2000C微量紫外分光光度計：美國Nano Drop公司；DYY-12電泳儀：北京六一儀器廠；MiSeq高通量測序平臺：美國Illumina公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 利川醬豆樣品基因組的提取

使用QIAGEN DNeasy maricon Food Kit DNA基因組提取試劑盒提取利川醬豆樣品的基因組DNA，并用1%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，將符合要求的DNA條帶置于-20 ℃保存備用。

1.3.2 PCR擴增及Illumina MiSeq高通量測序

以基因組DNA為模板，參考王丹丹等[21]的方法進行真菌18S核糖體核糖核酸（ribosomal ribonucleic acid，rRNA）PCR擴增及Illumina MiSeq高通量測序。PCR擴增體系：5×PCR緩沖液4 μL，dNTP Mix 2 μL，正向引物SSU0817F（5'-TTAGCATGGAATAATRRAATAGGA-3'，加入7個核苷酸通用標簽）0.8 μL，反向引物SSU1196R（5'-TCTGGACCTGGTGAGTTTCC-3'）0.8 μL，rTaq酶0.4 μL，DNA模板10 ng，雙蒸水（ddH2O）補至20 μL。PCR擴增程序：95 ℃預變性3min；95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，共30次循環；72 ℃再延伸10 min。PCR擴增結束后用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR擴增產物，檢測合格后委托上海美吉生物醫藥科技有限公司進行Illumina MiSeq高通量測序。

1.3.3 利川醬豆樣品生物信息學分析

將測序后的序列拼接后，進一步按照WANG Y Y等[22]的方法進行質控后篩選出優化序列。使用QIIME（v1.7.0）對樣品進行生物物種分析[23]；使用軟件PyNAST[24]對齊序列后，用軟件UCLUST[25]以97%相似性劃分操作分類單元（operational taxonomic units，OTU）；使用SILVA數據庫[26]在每個OTU中挑選一個代表性序列進行樣品的真菌分類信息分析。

1.3.4 多元統計學分析

使用R（v4.0.3）軟件繪制瀑布圖及相關性熱圖；使用軟件Origin 8.5繪制OTU出現次數統計圖、稀釋曲線圖、香農指數曲線圖和柱狀堆積圖；使用Excel 2019繪制餅圖。

2 結果與分析

2.1 利川醬豆樣品真菌菌群多樣性分析

2.1.1 利川醬豆樣品真菌菌群測序結果分析

對利川醬豆樣品進行高通量測序后，由測序結果可知，10個利川醬豆樣品經序列比對后成功得到365 351條序列，其中樣品LCJM1、LCJM2、LCJM3、LCJM4、LCJM5、LCJM6、LCJM7、LCJM8、LCJM9和LCJM10的序列總數分別為33 171條、40 474條、38 331條、44 969條、37 239條、33 051條、34 578條、36 619條、30 287條和36 632條。為評估樣品的測序量是否足夠，繪制利川醬豆樣品的稀釋曲線和香農指數曲線，結果見圖1。

圖1 利川醬豆樣品的稀釋曲線（A）和香農指數曲線（B）Fig.1 Dilution curves (A) and Shannon index curves (B) of Lichuan Jiangdou samples

由圖1A可知，10個利川醬豆樣品中發現物種數隨著序列數的增加而增加，說明新的種系型可能會隨著序列數的增加而被發現。由圖1B可知，10個利川醬豆樣品的香農指數隨著序列數的增加逐漸趨于平緩，說明隨著序列數的增加樣品中的多樣性不會再有變化，樣品的測序深度已足夠。由此可知，樣品的測序量能夠滿足要求，可進一步進行生物信息學分析。

2.1.2 利川醬豆樣品真菌OTU分析

將醬豆樣品中相對含量≥1%的OTU定義為核心OTU。OTU數量可反應出樣品中微生物的豐度[27]，本研究對樣品OTU水平上的真菌微生物進行多樣性分析，結果見圖2。

圖2 利川醬豆樣品中OTU出現次數統計結果Fig.2 Statistical result of OTU occurrence times in Lichuan Jiangdou samples

由圖2可知，10個利川醬豆樣品中共產生5 391個真菌OTU，其中有18個OTU在10個樣品中均出現，占OTU總數的0.33%，但這些OTU中所包含的序列條數為210 186條，占測序序列總數的57.53%；而利川醬豆樣品中僅出現1次的OTU有3 466個，占OTU總數的64.29%，但其包含的序列數為4 238條，僅占序列總數的1.16%。由此說明不同的利川醬豆樣品中有大量的共有真菌群落，盡管不同的醬豆樣品擁有大量的獨有菌群，但這部分微生物所占比例很低。為研究利川醬豆樣品中核心真菌群落組成及各自所占比例，本研究進一步對核心OTU的構成和相對含量進行了解析，其分析結果見圖3。

圖3 核心OTU的構成及相對含量分析結果Fig.3 Result of composition and relative content analysis of core OTU

由圖3可知，在10個利川醬豆樣品中的核心OTU共有5個，這些OTU占OTU總數的0.09%，但其所包含的序列數占總序列數的54.19%，分別為OTU4582（4.00%）、OTU4725（15.09%）、OTU4078（1.51%）、OTU1212（2.65%）和OTU1121（30.93%）。其中OTU1121隸屬于畢赤酵母屬（Pichia），OTU4582隸屬于德巴利氏酵母屬（Debaryomyces），OTU4078、OTU4725和OTU1212隸屬于曲霉屬（Aspergillus）。由此可見，Pichia、Debaryomyces和Aspergillus為利川醬豆中的優勢真菌。

2.2 利川醬豆樣品真菌菌群結構分析

由利川醬豆樣品的物種注釋結果分析發現，所有樣品中的真菌被鑒定為3個門、15個綱、27個目、34個科、45個屬。本研究將樣品中相對含量＜1.0%的細菌門或屬歸為其他類（others），平均相對含量≥1.0%的細菌門或屬定義為核心細菌門或屬。基于門水平對利川醬豆樣品中的真菌菌群結構進行分析，結果見圖4。

圖4 基于門水平利川醬豆樣品真菌菌群結構分析結果Fig.4 Analysis results of fungal flora structure of Lichuan Jiangdou samples based on phylum level

由圖4可知，10個利川醬豆樣品中被鑒定出的真菌門有子囊菌門（Ascomycota）、擔子菌門（Basidiomycota）和毛霉亞門（Mucoromycotina），其平均相對含量分別為96.79%、2.63%和0.02%，其中Ascomycota和Basidiomycota為核心真菌門（平均相對含量≥1%），毛霉亞門（Mucoromycotina）只在樣品LCJM1、LCJM3、LCJM5和LCJM6中存在，且平均相對含量低，分別為0.006%、0.02%、0.16%和0.16%。進一步基于屬水平對利川醬豆樣品中的真菌菌群結構進行分析，結果見圖5。

由圖5可知，10個利川醬豆樣品中的核心真菌屬為畢赤酵母屬（Pichia）、曲霉屬（Aspergillus）、德巴利氏酵母屬（Debaryomyces）、假絲酵母屬（Candida）、Starmerella、節擔菌屬（Wallemia）和鐮刀菌屬（Fusarium），其平均相對含量分別為37.46%、29.48%、3.92%、2.86%、2.62%、2.19%和1.03%。通過進一步分析核心真菌屬在不同樣品中的分布，發現Starmerella未在樣品LCMJ4中鑒定出，Wallemia未在樣品LCMJ5中鑒定出，而Pichia、Aspergillus、Debaryomyces、Candida和Fusarium在10個利川醬豆樣品中均存在。除此之外，還有15.72%的真菌序列未鑒定到屬水平，因此，利川醬豆樣品中的真菌資源仍有待發掘。

圖5 基于屬水平利川醬豆樣品真菌菌群結構分析結果Fig.5 Analysis results of fungal flora structure of Lichuan Jiangdou samples based on genus level

畢赤酵母屬（Pichia）作為利川醬豆樣品中的優勢真菌屬，研究發現，其為非釀酒酵母且在自然界中分布較為廣泛，因其獨特的生理特性，可作為一種拮抗微生物而應用到生物防治中[28]；德巴利氏酵母屬（Debaryomyces）能夠通過代謝乳糖、蛋白質和乳酸鹽而產生香味，同時也會產生一些有助于人體消化的小分子物質[29]；曲霉屬（Aspergillus）作為利川醬豆的優勢真菌屬，是一類絲狀真菌，在自然界中分布廣泛，其代謝的產物（多糖類、蒽醌類和生物堿類等）具有抗病毒、抗菌、抗氧化和抗癌等功能，且其廣泛應用于發酵食品中，如醬油、醋等[30-31]；由于利川醬豆發酵的開放環境，導致了醬豆在發酵過程中微生物的多樣性，因此在發酵過程中也會產生一些不利于人體健康的真菌屬，如鐮刀菌屬（Fusarium），該菌屬可侵染植物造成植物的腐爛從而導致減產，有些鐮刀菌屬（Fusarium）可產生真菌毒素，食用后會造成食物中毒[32]。

2.3 核心真菌群落間的相關性分析

微生物彼此間相關關系的解析對于醬豆制品后續的標準化生產和品質控制必不可少，為進一步確定利川醬豆樣品中核心真菌群落之間的相關性，本研究對醬豆樣品的核心真菌屬間及核心OTU間的相關性進行了分析，結果見圖6。

圖6 核真菌屬間（A）和核心OTU間（B）相關性分析結果Fig.6 Results of correlation analysis between core fungi (A) and core OTUs (B)

由圖6可知，在利川醬豆樣品的核心真菌屬之間，其相關性均不顯著（P＞0.05）；核心OTU之間的相關性也均不顯著（P＞0.05）。由此可知，核心真菌群落間相關性不顯著（P＞0.05）。

3 結論

采用Illumina MiSeq高通量測序對利川醬豆樣品真菌多樣性進行解析，結果顯示，利川醬豆樣品中的真菌菌群隸屬于3個門、15個綱、27個目、34個科、45個屬，核心真菌門為子囊菌門（Ascomycota）（96.79%）和擔子菌門（Basidiomycota）（2.63%）；核心真菌屬為畢赤酵母屬（Pichia）（37.46%）、曲霉屬（Aspergillus）（29.48%）、德巴利氏酵母屬（Debaryomyces）（3.92%）、假絲酵母屬（Candida）（2.86%）、Starmerella（2.62%）、節擔菌屬（Wallemia）（2.19%）和鐮刀菌屬（Fusarium）（1.03%），且核心真菌之間的相關性均不顯著（P＞0.05）。