N6-甲基腺苷修飾在HBV感染中的作用

薛 萍， 范 超

空軍軍醫大學第二附屬醫院 傳染科， 西安 710038

RNA轉錄后修飾在真核生物中較為普遍。其中，N6-甲基腺苷(N6-methyladenosine, m6A)修飾的生物學作用逐漸受到重視[1]。據估計[2]，細胞中25%的mRNA存在m6A修飾。而長鏈非編碼RNA(lncRNA)、微小RNA(miRNA)和病毒轉錄產物等RNA分子中也存在m6A修飾現象。自1970年起，RNA分子中的m6A甲基化現象被陸續發現，當時的m6A檢測主要依靠水解或核酸酶消化放射性標記的RNA和色譜分析。時至今日，MeRIP-seq、PA-m6A-seq、miCLIP、m6A-LAIC-seq和SELECT等技術陸續被開發，使m6A功能相關研究得以更全面地開展[3-7]。

m6A修飾既有普遍性，又有序列特異性。多數m6A位點修飾以相似的分布方式存在于相應的mRNA中，主要發生在RRACH基序(R=A或G；H=A、C或U)上，位點常聚集在轉錄起始點、剪接位點側翼的外顯子區、終止位點、5′非翻譯區(5′UTR)和3′非翻譯區(3′UTR)附近。基因的功能常與m6A豐度相關，例如調節發育和細胞命運的基因往往含有更高的m6A修飾[5]。其功能涉及：RNA的穩定性、剪接、核輸出、折疊、翻譯調節和降解等；參與的生物學過程包括：細胞重編程、干細胞分化、細胞增殖、細胞的應激反應、晝夜節律的調控和癌癥的發生等[8]。

m6A修飾不僅存在于真核細胞的內源性RNA中，也同樣存在于病毒基因轉錄本中。例如猿猴病毒40、甲型流感病毒和腺病毒等的mRNA中均存在m6A修飾[9]。研究[10-11]發現，HBV感染同樣受到m6A修飾的調節。使用siRNA基因沉默m6A甲基轉移酶——甲基轉移酶樣蛋白(methyltransferase-like protein，METTL)3/14可促進HBc和HBs的表達。同樣，如果基因沉默m6A結合蛋白YTHDF2/3，也會得到相似的結果。相反，如果基因沉默m6A去除蛋白FTO和ALKBH5，則會抑制HBc和HBs等病毒蛋白的表達[12]。

1 m6A修飾的基本過程和參與蛋白

m6A修飾的基本過程包括m6A的寫入、擦除和識別。m6A修飾受三類蛋白的調節，即甲基轉移酶(或稱“寫入器”)、去甲基化酶(或稱“擦除器”)以及m6A結合蛋白(或稱“讀取器”)。m6A修飾由甲基轉移酶引入，可被去甲基化酶消除，并通過m6A結合蛋白調節RNA的結構和功能(圖1)。“寫入器”由METTL3/14/16、維爾姆斯腫瘤相關蛋白(Wilms tumor associated protein，WTAP)、RNA結合基序蛋白15和KIAA1429等亞基構成[13]。METTL3/14為復合物的核心成分，WTAP為調節亞基。RNA結合基序蛋白15和KIAA1429等蛋白也可影響“寫入器”的活性[14]。METTL16獨立于METTL3/METTL14/WTAP復合物，介導U6 snRNA和甲硫氨酸腺苷轉移酶2A mRNA的m6A修飾[15-16]。m6A修飾位點產生后，可通過alkB同源物5或脂肪量和肥胖相關蛋白等去除。脂肪量和肥胖相關蛋白除對m6A修飾具有去除作用外，還參與單鏈DNA或RNA中3-甲基胸腺嘧啶或3-甲基尿嘧啶的去甲基化[14]，并可介導N6,2′-O-二甲基腺苷(m6Am)的去除[15]。m6A“讀取器”的成員包含：YTH家族蛋白1/2/3(YTH domain family protein1/2/3，YTHDF1/2/3)、YTH結構相關蛋白(YTH domain containing1/2，YTHDC1/2)等。YTHDF1可通過與3′UTR區域的m6A位點結合增強mRNA的翻譯活性；YTHDF2招募CCR4-NOT復合蛋白來促進mRNA的降解；YTHDF3為YTHDF1和YTHDF2調節亞基[17-18]。YTHDC1可調節mRNA從細胞核到細胞質的運輸[19]，YTHDC2可與細胞質中的核糖體亞基相互作用，調節RNA的翻譯[19]。此外，廣義的m6A“讀取器”還包括胰島素樣生長因子2-mRNA結合蛋白(insulin-like growth factor 2 mRNA-binding protein，IGF2BP)和真核起始因子3(eukaryotic initiation factor 3，eIF3)等[20]。IGF2BP通過GG(m6A)C基序與m6A位點結合，以促進mRNA的穩定性；eIF3通過與mRNA 5’UTR 區的m6A位點結合來促進蛋白質翻譯[20]。

2 HBV轉錄物的m6A修飾

在HBV的復制周期中，HBV可轉錄產生前基因組RNA(pregenomic RNA，pgRNA)，后者在細胞質核心顆粒中被逆轉錄為松弛的環狀DNA，隨后環狀DNA在細胞核中轉化為共價閉環DNA，并利用細胞RNA聚合酶Ⅱ合成病毒RNA[21]。HBV基因轉錄從不同的轉錄起始位點開始，但共用同一個轉錄終止信號。因此，HBV轉錄本具有不同的5′末端，但具有共同的3′末端序列[22]。HBV轉錄產物中包含m6A共有的DRACH基序(GGACA)，位于HBV轉錄物的epsilon-莖環區域(A1907)內。由于HBV基因存在冗余重復，該基序在pgRNA的5′和3′末端重復2次，但在亞基因組轉錄本的3′UTR中僅存在1次[23]。這些m6A修飾位點可被“閱讀器”識別并促進HBV RNA的細胞質轉運和pgRNA包裝。在YTHDC1敲除細胞中，病毒轉錄物在細胞核中積累，病毒復制和共價閉環DNA合成受到顯著抑制。

HBV RNA不同位置的m6A修飾具有不同的生物學功能。位于HBV轉錄本3′-epsilon莖環的m6A修飾可降低病毒轉錄物的穩定性，從而抑制病毒蛋白的表達。這種RNA穩定性的降低由YTHDF2/3介導。因此，基因沉默這些蛋白可增強HBV蛋白表達。同樣，當3′-epsilon莖環m6A位點發生突變時，HBV蛋白的表達也被會增強。另一方面，位于pgRNA 5′-epsilon莖環中的m6A位點則可通過促進逆轉錄酶的識別，正向調節病毒的逆轉錄活性[10]。同時，由于pgRNA 5′-epsilon莖環結構可被視黃酸誘導基因Ⅰ(retinoic acid inducible gene Ⅰ，RIG-Ⅰ)識別，從而刺激干擾素(IFN)合成。而m6A修飾的存在可以降低RIG-Ⅰ的親和力[24]。因此，HBV RNA的m6A 修飾可作為降低RIG-Ⅰ識別自身與非自身RNA的一種特殊手段。

3 m6A參與HBV感染免疫應答

HBV RNA的m6A修飾可調節宿主的免疫應答過程。HBV RNA的m6A修飾在IFNα誘導的病毒RNA降解中發揮作用，YTHDF2作為識別因子介導HBV RNA的降解[28]。在HBV感染的IFN治療過程中，IFNα通過IFN刺激基因20(interferon stimulating gene，ISG20)的核酸外切酶活性降解病毒RNA[25]。研究[26]發現，ISG20可被YTHDF2識別。YTHDF2將ISG20遞送至HBV RNA的m6A甲基化位點，從而對病毒RNA進行降解。相反，如果突變HBV RNA的m6A位點，則ISG20介導的病毒RNA降解過程會被削弱[25-26]。病毒感染激活宿主模式識別受體(pattern recognition receptor，PRR)可檢測病原體相關分子模式，啟動固有免疫反應對抗病毒感染。而識別外來RNA的PRR依賴于特定的分子特征來區分自身與非自身RNA。如前所述，HBV pgRNA 5′-epsilon莖環上的m6A修飾降低了RIG-Ⅰ的信號活性，抑制RIG-Ⅰ對病毒RNA的識別過程[24]。同時，由于m6A修飾位點的存在，YTHDF2可與HBV RNA的RIG-Ⅰ配體識別區結合，進一步阻斷RIG-Ⅰ信號轉導。因此，YTHDF2通過將病毒RNA與RIG-Ⅰ隔離來抑制RIG-Ⅰ對HBV RNA的感知[22]。

4 HBV感染對m6A修飾的影響

HBV感染可誘導宿主細胞m6A修飾譜發生顯著變化[27]。例如，磷酸酶和張力蛋白同源蛋白(phosphatase and tesion homologue deleted on chromosome ten，PTEN)的轉錄產物在HBV感染過程中表現出異常的m6A修飾，這種修飾可降低PTEN的穩定性，減少PTEN的表達水平。PTEN可通過誘導干擾素調節因子3(interferon regulatory factor，IRF-3)的 Ser-96磷酸化促進IRF-3核轉位，從而激活IFN信號[28]。因此，HBV上調PTEN的m6A修飾過程抑制了宿主的抗病毒免疫反應[27]。HBV可利用特殊機制指導自身RNA的m6A修飾[29]。例如，HBx可通過調節病毒RNA的m6A修飾影響病毒的感染周期。在HBV感染期間，HBx可與m6A甲基轉移酶相互作用，促進其核轉移過程，從而增強m6A甲基轉移酶對HBV轉錄產物的m6A修飾作用。因此，HBx缺陷型的HBV感染不能有效產生m6A修飾的病毒RNA[29]，進而阻斷SMC5/6復合物的激活和HBx-DDB介導的RNA降解活性[30]。HBx還可促進m6A甲基轉移酶向PTEN基因的募集，從而將m6A添加到PTEN轉錄本中[27]。

圖1 m6A修飾的基本過程和參與蛋白

5 m6A修飾與HBV相關肝細胞癌(HCC)

HBV慢性感染是HCC的最主要原因[10,31]，越來越多的證據[35-36]表明，m6A相關蛋白的異常表達與HCC相關。例如，m6A修飾可通過METTL3/14參與HCC進程。HCC中異常表達的METTL3促進HCC的細胞增殖、遷移和集落形成[32]。細胞因子信號抑制因子2(suppressor of cytokine signaling 2，SOCS2)是METTL3介導的m6A修飾的靶基因，METTL3可通過YTHDF2介導的m6A識別促進SOCS2 mRNA的降解，從而使細胞失去SOCS2相關的抑癌信號。另一方面，METTL14在HCC中顯著下調，其表達水平與腫瘤復發和生存預后相關。METTL14通過促進DiGeorge綜合征相關結構域基因8與miRNA初級轉錄產物(pri-miR)的識別，調節pri-miR126向miR126的成熟，最終促進腫瘤分化和微血管浸潤[9]。此外，HBV感染調節PTEN的m6A甲基化，減少PTEN表達。PTEN是一種重要的腫瘤抑制蛋白[33]，PTEN水平降低將在一定程度上誘導HCC的發生[34]。HBx誘導circ-ARL3的m6A修飾有利于circ-ARL3反向剪接和生物發生，circ-ARL3能夠吸附miR-1305，拮抗癌基因作用，從而促進HBV相關HCC進展[35](圖2)。

6 小結與展望

病毒基因組及轉錄物的m6A修飾與病毒的發病機制密切相關[10,36-38]。本文討論了HBV感染過程中發現的m6A修飾，這些研究結果為了解m6A在病毒-宿主相互作用中的功能提供了新的證據，也可能為基于m6A的治療干預提供新的途徑，但依然有很多問題值得進一步研究。近期，本實驗室通過收集不同HBV感染者臨床樣本開展m6A修飾譜分析，發現不同HBV感染者間的細胞m6A修飾存在明顯差異，表明m6A修飾可能對HBV感染免疫應答具有重要意義，其具體機制將在后續研究中深入討論。作為一種具有應用前景的分子靶點，m6A是否可以成為HBV預后和診斷標志物，以及在藥物篩選中的潛力依然有待發掘。同時，還應注意到，除了m6A修飾外，病毒轉錄本還存在其他化學修飾，包括5-甲基胞嘧啶、尿苷向假尿苷的編輯以及腺苷到肌苷的編輯等[39]；而在病毒基因組中也報道了其他形式的表觀轉錄組修飾，包括5-甲基胞苷、N4-乙酰胞苷，但上述修飾的具體功能依然有待研究[39-40]。相關RNA修飾的機制和功能是否類似m6A修飾，對該問題的深入分析具有重要的生物學意義。

圖2 HBV感染過程中m6A甲基化的調控作用

利益沖突聲明：所有作者均聲明不存在利益沖突。

作者貢獻聲明：薛萍負責收集數據，資料分析，撰寫論文；范超負責擬定寫作思路，指導撰寫文章并最后定稿。