治療慢性乙型肝炎新藥研發(fā)的研究進展

劉義思， 陳新月

首都醫(yī)科大學附屬北京佑安醫(yī)院 肝病中心一科， 北京 100069

目前全球仍約有2.57億慢性HBV感染者，如不進行治療，會有20%甚至更多的慢性感染者發(fā)展為終末期慢性肝病，如肝硬化或肝細胞癌(HCC)[1]。抗病毒治療是慢性乙型肝炎(CHB)患者最重要的治療，通過抗病毒治療可以抑制HBV的復制，減輕肝細胞炎癥及纖維組織增生，以減少肝衰竭、肝硬化失代償以及HCC的發(fā)生[2]。然而當下還沒有一種藥物可以完全清除感染肝細胞中的共價閉合環(huán)狀DNA(cccDNA)，這也是當前的抗病毒藥物不能治愈CHB的主要原因[3-4]。隨著現(xiàn)代醫(yī)藥水平的進步以及對HBV復制周期的深入了解，不同靶點的新型藥物正處于研發(fā)和臨床試驗階段，這些藥物對于治療CHB有著重大的意義。

目前治療CHB的新藥大致分為兩類[3]。第一類主要針對HBV的生命周期：包括阻止HBV進入細胞、直接靶向cccDNA、靶向HBV基因表達、抑制核衣殼組裝和HBsAg釋放等。第二類主要針對宿主的免疫系統(tǒng)：包括固有免疫和適應性免疫。由于針對不同靶點的新藥種類眾多，在此僅討論臨床試驗數(shù)據(jù)較詳盡的代表性藥物(圖1)。

圖1 HBV生命周期及相關藥物靶點

1 進入抑制劑(Entry inhibitor)

北京生命科學研究所李文輝團隊[5]于2012年在世界上首次發(fā)現(xiàn)鈉離子-牛磺膽酸共轉運蛋白(sodium taurocholate contransporting polypeptide，NTCP)是HBV進入人體肝細胞的特異性受體。NTCP是一個多重跨膜的蛋白分子，HBV通過L-HBsAg 的前S1區(qū)與肝細胞表面的NTCP結合，介導HBV進入細胞[6]。這一發(fā)現(xiàn)不僅大大促進了HBV感染相關的研究，同時為HBV新藥研發(fā)提供了新靶標。

基于Myrcludex B的使用，德國的海德堡大學醫(yī)院Stephan Urban團隊[7]提出了HBsAg阻斷策略。Myrcludex B 是L-HBsAg的前S1結構域內47個氨基酸衍生的肉豆蔻酰化脂肽，通過競爭性與NTCP受體結合，進而抑制HBV進入肝細胞[8]。而Hepcludex B(Bulevirtide)則是由德國的MYR GmbH公司與俄羅斯的Hepatera Ltd公司合作研制的皮下注射型Myrcludex B。早些年作為治療丁型肝炎的藥物，Bulevirtide的臨床試驗進展較快，已于2020年在歐洲上市，批準劑量為2 mg/d[9]。而作為治療乙型肝炎的藥物，目前尚處于臨床試驗Ⅱ期階段。研究結果表明，對于HBeAg陰性的CHB患者，2 mg的Hepcludex B和聚乙二醇干擾素(PEG-IFN)聯(lián)用體現(xiàn)出顯著的協(xié)同作用：治療48周結束時，46.7%(7/15)的患者HBsAg下降>1 log10，有20%(3/15)的患者出現(xiàn)HBsAg的丟失[10]。Bulevirtide的安全性與耐受性均良好，最常見的不良反應是總膽鹽的升高和注射部位的反應，但停止治療后均可逆轉[9-11]。從現(xiàn)有的實驗結果來看，Bulevirtide單藥治療下降HBsAg效果并不明顯，而聯(lián)合PEG-IFN治療可提高降低HBsAg的能力。不過目前該藥物對于HBV DNA影響的試驗結果較少，以后與PEG-IFN或核苷類似物(NUC)等抑制病毒復制的藥物聯(lián)用具有良好的臨床應用前景。

2 靶向cccDNA

CRISPR/Cas9在2013年被發(fā)現(xiàn)可高效的編輯基因，成為繼ZFN、TALEN技術之后出現(xiàn)的第三代基因編輯工具[12-14]。作為HBV復制的模板，很少有藥物可以直接作用于cccDNA，這也是CHB難以治愈的主要原因。核酸內切酶介導的cccDNA突變是目前唯一在實驗中建立的可以使cccDNA永久失活的方法[15]。臨床前實驗[16-19]表明，CRISPR/Cas9可以導致cccDNA的功能突變和缺失，從而有效抑制HBV的復制和降低HBsAg的表達。雖然CRISPR/Cas9仍處于臨床前實驗階段，但目前的研究已經證實其在治療HBV感染方面具有很大的潛力，不僅僅是臨床治愈，更有望徹底治愈乙型肝炎。今后的研究需要克服CRISPR/Cas9技術可能存在藥物脫靶效應、HBV DNA雙鏈斷裂損傷后的修復以及對宿主細胞基因組的影響等潛在問題。

3 靶向病毒mRNA

目前靶向病毒mRNA進展較快的策略主要是RNA干擾(RNA interference，RNAi)和反義寡核苷酸(antisense oligonucleotides，ASO)。

3.1 小干擾RNA(small interfering RNA，siRNA) siRNA通常為19～25 bp短雙鏈RNA，主要參與RNAi[20]，通過靶向與HBV轉錄的mRNA堿基互補結合并對其進行降解來阻止基因翻譯[21]。

首個進入臨床研究的siRNA藥物是美國Arrowhead公司研發(fā)的ARC-520。早期該藥物在小樣本試驗中表現(xiàn)出良好降低HBsAg的能力，并且對HBeAg陽性的患者更有效[22]。但因該藥物在靈長類動物黑猩猩試驗造成了死亡，研發(fā)已于2016年被叫停。JNJ-3989(ARO-HBV)是Arrowhead公司研發(fā)的第二代siRNA藥物。臨床試驗[23]的研究結果顯示，對于40例HBeAg陽性CHB患者不同劑量的JNJ-3989皮下注射(每月1次，共3次)，各劑量的JNJ-3989均可有效降低HBsAg，無明顯劑量依賴。每月接受300 mg的NUC經治患者HBsAg最大減少2.5 log10，而初治患者HBsAg最大減少2.3 log10。有97%的患者治療約90天時HBsAg降低>1 log10。其他病毒學指標如HBV DNA、RNA、HBeAg較基線水平都有不同程度的下降。但是后續(xù)的觀察發(fā)現(xiàn)，患者在停用JNJ-3989后HBsAg基本未繼續(xù)下降，且有回升趨勢[24]。治療期間并未出現(xiàn)嚴重的不良反應。JNJ-3989目前已經進入Ⅱb期臨床試驗階段。

VIR-2218(ALN-HBV02)是由美國Alnylam和Vir Biotech公司聯(lián)合開發(fā)的siRNA類藥物。關于VIR-2218安全性和抗病毒活性的研究[25]顯示，2次皮下注射VIR-2218治療后，大多數(shù)患者在第12周達到最大HBsAg下降幅度，平均比基線HBsAg水平下降1.5 log10。并且無受試者因不良事件而終止治療，大多不良反應為輕度，未觀察到ALT的顯著升高。在2021年歐洲肝病學會(EASL)年會上發(fā)表的另一項VIR-2218聯(lián)合PEG-IFN治療的部分數(shù)據(jù)[25]表明，治療24周時聯(lián)合治療組HBsAg下降幅度大于VIR-2188單藥治療組(分別是1.8和1 log10)。不過與JNJ-3989類似，在VIR-2218停藥后HBsAg也有回升的趨勢。目前VIR-2218的Ⅱ期研究正在積極尋找多種方案的聯(lián)合治療。

其他siRNA藥物，如羅氏(Roche)公司的RG6346(DCR-HBVS)和美國Arbutus公司的AB-729(GalNAc-RNAi)也均處于Ⅱ期試驗階段(表1)。總體來說siRNA的HBsAg下降效果較好，但是單一治療下降幅度有限，且停藥后可導致HBsAg的反彈。不過與PEG-IFN的聯(lián)合用藥效果更佳顯著，未來多藥物聯(lián)合的抗病毒治療方案前景令人期待。

3.2 反義寡核苷酸(ASO) ASO是長度為8～50 bp人工合成的小單鏈核酸，它們與靶mRNA堿基互補配對結合后，通過核糖核酸酶H依賴的切割機制降解病毒的mRNA[26]。

GSK3228836(IONIS-HBVRx)由美國Ionis公司和葛蘭素史克公司研發(fā)，該藥是無配體的ASO類藥物。GSK3228836的Ⅱ期臨床試驗給予患者6次共1800 mg的IONIS-HBVRx皮下注射，治療29天時NUC經治患者HBsAg較基線相比平均下降2.5 log10，初治患者HBsAg較基線相比平均下降1.6 log10[27]。最常見的不良事件為注射部位的反應，發(fā)生率為29.4%(5/17)。然而治療后HBsAg低于檢測下限的患者均有ALT驟升，其中1例患者ALT最高至781 U/L，其余患者多為(1.7～15)×ULN。ALT驟升不伴隨其他癥狀，并且可以自行下降，研究者考慮這與HBsAg下降有關。目前該藥物處于Ⅱ期階段。

RO-7062931是由羅氏公司研制的一類與N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)偶聯(lián)的ASO類藥物，配體可以增強藥物的靶向性，從而降低所需藥物的劑量和頻率[28-29]。該藥物早期研究[30]結果顯示，在NUC經治的患者中，僅有1例患者HBsAg下降達1 log10，并且停止治療后約12周，HBsAg水平逐漸恢復到基線水平。隨后羅氏公司認為RO-7062931不太可能成為一線的抗乙型肝炎藥物而停止了該藥物的研發(fā)。

作為GalNAc偶聯(lián)的藥物，羅氏的RO-7062931降低HBsAg的效果遠不如GalNAc偶聯(lián)的siRNA類藥物，比如同為羅氏的RG6346和Arrowhead的JNJ-3989。有研究者認為這可能與兩類藥物機制有關。另外，無配體的ASO藥物GSK3228836可使HBsAg下降幅度更大，這或是更高劑量暴露引起(4周內的總劑量達到了1800 mg)。如何在提高靶向性和安全性的同時增強藥效，將成為ASO類藥物將來面臨的重要難題。

4 核心蛋白變構調節(jié)劑(CpAM)

核心蛋白由pgRNA翻譯而來， 240個核心蛋白相互結合形成一個完整的核衣殼[31-33]。CpAM是以核心蛋白為靶點的一類抗病毒藥物，其通過改變核心蛋白的構象來干擾核衣殼的裝配，進而影響病毒分子組裝和逆轉錄等過程，最終抑制HBV復制。根據(jù)機制可將CpAM分為兩類，Ⅰ類CpAM誘導異常核衣殼或非核衣殼核心蛋白的組裝，形成異常組裝的核衣殼，隨后在肝細胞中降解；Ⅱ類CpAM則形成不能包裹pgRNA的“正常形狀”核衣殼，即空衣殼。

GLS4(甲磺酸莫非賽定)是由我國東陽光藥業(yè)開發(fā)的一款Ⅰ類CpAM藥物。該藥Ⅰb期的臨床試驗比較了不同劑量GLS4和恩替卡韋(ETV)單藥治療的效果，治療結束時各組HBV DNA、pgRNA下降水平無明顯差異[34]。隨后2020年EASL年會上研究人員公布了GLS4的Ⅱb期臨床研究階段性的數(shù)據(jù)[35]。兩組CHB患者分別接受了12周的GSL4聯(lián)合ETV或ETV單藥治療。半年內未接受過抗病毒治療者中，聯(lián)合治療組HBV DNA和pgRNA較基線水平下降分別為5.02 log10和1.59 log10，均高于ETV單藥治療組的3.84 log10和0.37 log10。而在ETV經治患者中，聯(lián)合治療組pgRNA下降水平也顯著高于ETV單藥治療組(分別是1.59 log10和0.15 log10)。研究表明聯(lián)合用藥安全性和耐受性良好。最常見的不良反應是ALT升高，多數(shù)為輕中度升高，且不需藥物治療。研究者分析這可能與HBV DNA水平降低有關。另一款羅氏公司研發(fā)的Ⅰ類CpAM藥物RG7907也進入了Ⅱ期階段。

表1 治療CHB的在研藥物

ABI-H0731是由美國Assembly Biosciences公司和我國BeiGene公司研發(fā)的一種Ⅱ類CpAM藥物。該藥的Ⅱ期試驗結果同GLS4相似[36]，無論是在NUC經治或是初治患者中， ETV+ ABI-H0731組HBV DNA/RNA下降幅度均高于ETV+安慰劑組。

CpAM作為一類新興的抗HBV藥物，早期臨床研究發(fā)現(xiàn)單一治療的抗病毒作用相比于NUC并無明顯優(yōu)勢，而聯(lián)合NUC治療時對HBV DNA和RNA的抑制效果比單用NUC更加顯著。不過CpAM+NUC聯(lián)用方案對于HBsAg下降效果并不明顯，未來與PEG-IFN等藥物聯(lián)用的抗病毒方案可能具有良好的前景。

5 HBsAg抑制劑

HBsAg抑制劑是一種核酸聚合物(nuleic acid polymers，NAP)，該類化合物可以阻止細胞內亞病毒顆粒的組裝，從而抑制HBsAg的分泌[37]。而細胞內的HBsAg通過蛋白酶體或自噬相關途徑降解，使得HBsAg不會在胞內累積[38-39]。

目前最具代表性的NAP藥物是由加拿大Replicor公司研制的REP 2139和REP 2165。REP 2139的單藥治療在臨床試驗中表現(xiàn)出色[40]。12例初治HBeAg陽性的CHB患者中有9例血清HBsAg較治療前下降2.79～7.10 log10，其中3例患者出現(xiàn)HBsAg的清除。在隨后的Ⅱ期試驗中[41]，Replicor公司又評估了REP 2139/REP 2165聯(lián)合替諾福韋酯(TDF)和PEG-IFN的安全性和有效性。接受實驗性療法(REP 2139/REP 2165+TDF+PEG-IFN)的20例患者中有15例在10周內HBsAg迅速下降4～6 log10，并且治療48周時共有11例患者出現(xiàn)HBsAg血清學轉換。而接受對照療法(TDF+PEG-IFN)的20例患者中只有3例HBsAg下降>1 log10，并且沒有患者出現(xiàn)HBsAg血清學轉換。治療期間兩組HBV DNA下降趨勢相似，48周時兩組共有18例患者HBV DNA低于檢測下限。雖然在HBsAg下降期間，共有37例患者出現(xiàn)ALT的升高，試驗組ALT升高的幅度更大，不過大多患者在后續(xù)治療過程中均自行緩解。

NAP類藥物降低HBsAg的能力顯著，是目前眾多抗HBV新藥中降低HBsAg效果最好的。其與PEG-IFN和NUC三藥聯(lián)用的治療方案目前看來耐受性和安全性良好，并且在隨訪期間未出現(xiàn)病毒學指標反彈，與其他抗病毒藥物聯(lián)合療法可能成為抗HBV治療的趨勢。

6 針對固有免疫的策略

HBV可依托自身多種蛋白質成分，干擾Toll樣受體(TLR)或維甲酸誘導基因Ⅰ(RIG-Ⅰ)兩種抗病毒信號轉導途徑，從而抑制固有免疫應答強度[2,42-43]。所以利用細胞因子(IFNα、IFNγ等)或模式識別受體激動劑(TLR、RIG)激活肝細胞和NK細胞等可以強化固有免疫反應[3]。固有免疫可直接抑制肝細胞內病毒復制。

GS-9688(Selgantolimod)是由美國吉利德(Gilead)公司開發(fā)的一種TLR-8激動劑[44]。然而該藥的Ⅱ期臨床研究結果[45]顯示，口服3 mg的GS-9688治療24周，僅使21%(4/19)HBeAg陰性的患者HBsAg下降>0.1 log10。由美國Spring Bank公司研制的一種RIG-Ⅰ激動劑SB-9200(Inarigivir)在早期臨床研究[46]中顯示出一定下降HBV DNA和HBsAg的作用，但是該藥在隨后的試驗中2例患者出現(xiàn)了重度不良反應，嚴重的肝毒性導致其中1例患者死亡[47]。Spring Bank公司在2020年初終止了該藥的研發(fā)。

針對固有免疫的新藥臨床試驗效果并不理想，目前也正在積極尋找與其他藥物聯(lián)用的策略。如何在提高療效的同時，提高藥物安全性和保證患者安全仍是今后該藥物研制的方向。

7 針對適應性免疫的策略

慢性HBV感染時，T淋巴細胞長時間暴露于大量病毒抗原以及肝細胞免疫耐受導致HBV特異性T淋巴細胞的功能衰竭[48-49]。缺陷的HBV特異性T淋巴細胞功能可以通過治療性疫苗和免疫檢查點抑制劑來恢復。

治療性疫苗通過設計HBV特異抗原來刺激抗病毒效應細胞，打破免疫耐受，激發(fā)對HBV的特異性免疫反應。治療性疫苗的研制相比于其他抗乙型肝炎新藥開始的較早，但是多項臨床試驗結果表明治療性疫苗的效果并不理想：由古巴CIGB研制的NASVAC在治療NUC經治患者和攜帶者的研究[50]中，治療6個月僅有5.6%(4/71)的患者出現(xiàn)HBsAg的清除；由美國吉利德和GlobeImmune公司研發(fā)的GS-4774與NUC聯(lián)合治療對于HBsAg的下降幅度相較于NUC單藥治療并無明顯差異，且并沒有患者出現(xiàn)HBsAg清除[51]。如何提高HBV特異性免疫細胞的應答強度與時間，是治療性疫苗未來研發(fā)過程中面臨的挑戰(zhàn)。可能需要選擇更合適的佐劑和抗原與遞呈方式，或者需要聯(lián)合其他類型藥物的抗病毒治療方案。

免疫檢查點抑制劑通過靶向阻斷抑制受體的負調控信號達到恢復HBV特異性CD8+T淋巴細胞的功能。我國歌禮公司(Ascletis)研發(fā)的ASC-22是一款皮下注射的PD-L1抗體。該藥物早期試驗[52]結果表明， HBsAg呈劑量依賴性下降，且不同劑量組均表現(xiàn)出良好的安全性和耐受性。目前該藥處于Ⅱ期階段。近些年免疫檢查點抗體相關藥物在治療腫瘤領域進展較快，然而在治療CHB進入臨床試驗的藥物不多，不過基于恢復HBV特異性免疫細胞功能的特性在將來治療HBV感染方面值得期待。

8 展望

過去幾十年，乙型肝炎疫苗的全面推廣、抗HBV新藥的不斷研發(fā)，均使乙型肝炎的防治工作取得了長足的進步。目前臨床上使用PEG-IFN和NUC兩類抗HBV藥物雖然可以有效抑制病毒復制，促進HBeAg血清學轉換，但達到功能性治愈仍比較困難，更無法徹底清除HBV。cccDNA和整合DNA的存在以及HBV特異性免疫的調節(jié)仍是抗病毒治療方法上面臨的關鍵挑戰(zhàn)。就目前新藥研發(fā)的情況來看，盡管siRNA、CpAM等新藥進展較快，但進入臨床使用及治療仍需一定時間。并且新藥臨床試驗結果顯示單藥治療的效果和穩(wěn)定性不夠理想，而與PEG-IFN、NUC或其他藥物聯(lián)用時下降HBsAg或HBV DNA的能力明顯增強。所以針對生命周期和免疫系統(tǒng)，多靶點、多藥物聯(lián)合的治療方案可能成為將來治療HBV感染的趨勢。

利益沖突聲明：所有作者均聲明不存在利益沖突。

作者貢獻聲明：劉義思負責文獻檢索和撰寫；陳新月負責擬定寫作思路，終審定稿。