基于GAS、NO和MLCK信號通路觀察一指禪推法干預脾虛家兔的作用機制

曾林琳，王繼紅，黃澤芳，賈文瀚

(廣州中醫藥大學，廣東 廣州 510405)

一指禪推法是臨床常見的推拿手法，該手法適應癥廣泛，可用于治療胃脘痛、腹瀉、便秘等消化系統疾病，如曹仁發教授在臨床上運用一指禪推法治療腸易激綜合征[1]。在前期實驗中，閆冬等[2]研究不同頻率段一指禪推法對脾虛家兔胃腸黏膜形態學影響的實驗中得出，101～150次/min頻率段的一指禪推法干預后的脾虛家兔的胃腸黏膜最接近健康組家兔，因此本次實驗選取101～150次/min頻率段作為一指禪推法的頻率。另外，基于前期研究基礎，本實驗繼續采用MFF多點薄膜壓力傳感器測試手法壓力，該設備可以實時測試手法的壓力變化，根據多人多次進行的手法模擬操作，經過反復測定和觀察評估，最終選定以150 mN作為該手法統一的壓力值。由于人工智能機械臂可通過相應軟件量化各項操作數據，故本次實驗將采用人工智能機械臂模擬操作一指禪推法。功能性消化不良是臨床上發病率較高的消化系統疾病，其病因為胃腸激素分泌異常，影響胃腸平滑肌收縮舒張，導致胃腸功能減退[3]。現代藥理研究表明，在胃腸道平滑肌細胞內的肌球蛋白輕鏈激酶(MLCK)通路可控制胃腸平滑肌的收縮舒張[4]，而石玉生等[5]通過以和解肝脾腹部推拿法干預非酒精性脂肪肝大鼠，發現腹部推拿法可通過調控腸組織MLCK信號通路,從而改善腸上皮屏障功能。綜上，本實驗研究中以脾虛型家兔為研究對象，選擇胃泌素(GAS)及一氧化氮(NO)為主要研究指標，探究抑制MLCK通路的情況下，一指禪推法能否影響脾虛型家兔的胃腸激素的分泌，如能影響，則可說明一指禪推法可通過其他通路或途徑對脾虛型家兔的GAS及NO產生作用。

1 材料和方法

1.1 實驗動物及其分組

選取普通成年新西蘭兔40只，體質量為(2.0±0.5)kg，雌雄各半，由廣東省醫學實驗動物中心提供，動物許可證號：SCXK(粵)219-0035，分籠飼養并于兔籠外貼標簽編為1～40號，其中1～20號置雌兔，21～40號置雄兔。在室溫24 ℃環境中，分籠適應性喂養7 d。待其進食，活動和糞便正常開始分組，具體為：每次分組在1～20號、21～40號各隨機取5只家兔組成1組，每組10只，共分為4組，分別為空白組(K組)、模型組(P組)、一指禪推法治療組(A組)、抑制劑組(I組，采用A組治療方法+腹腔注射ML-9)。

1.2 造模藥物的制備及造模過程

本實驗采用灌飼小承氣湯和饑飽失常法建立脾虛證家兔模型[2]，除K組外，P組、A組、I組均進行造模處理。本造模方法是將大黃36 g，厚樸27 g，枳實18 g混合(全部飲片均為袋裝可溶制劑，由廣州致信藥業有限公司提供)，加入650 mL蒸餾水浸泡30 min，將蒸餾水連同生藥一起倒入1000 mL燒瓶中，將燒瓶放在電熱套上，至藥汁沸騰45 min。倒出藥汁，在12層紗布上過濾2次，過濾后的藥汁倒入旋轉蒸發儀的燒瓶中，以70 ℃的溫度將藥汁濃縮至80 mL，即濃度為1 g/mL，按生藥6 g/kg體質量給藥。隔日灌胃1次，每次喂飼常規量飼料的一半，自由飲水，造模同時記錄家兔行為學改變。連續15 d可造成脾虛證功能性消化不良動物模型。

分別于造模前、后進行評估，記錄各組家兔癥狀變化，包括體質量、食量、大便次數及行為學改變等，記錄于“家兔行為學量表”上，用于綜合評價造模成功與否。造模組家兔體質量減輕、食量下降、大便次數增多及行為學差異，則可判斷造模成功。

1.3 主要實驗儀器、試劑及相關參數校對

1.3.1 實驗儀器

TEKSCAN壓力測試調制器、校對器、動態數據采集器及MFF多點薄膜壓力傳感器由上海邑成測試設備有限公司生產；智能機械臂(越疆科技，DOBOT魔術師)；家兔固定器(上?；茖嶒炂鞑?，PVC-01)；計時器(拜杰有限公司，cp-167)。

1.3.2 實驗試劑

ML-9試劑,是Akt激酶的選擇性強效抑制劑，可有效抑制MLCK活性，由生物制劑(北京)生物技術有限公司提供，批號：YZM002844。

1.3.3 相關參數校對

連接好相關器械后，將人工智能機械臂置于家兔腹部操作手法，并控制頻率處于101～150 次/min頻率段，施加同等力量值操作并保持1 min，在電腦上建立力-電壓之間的擬合函數模型y=a+bx，然后通過校對器得出曲線的標準力量值和頻率值，此后操作頻率都必須落在該組要求的頻率范圍內。手法操作時，壓力值采集選用MFF多點薄膜壓力測試系統，手法壓力值以觀察實時采集數據為度量標準，具體操作過程：共選取5名測試者各測試10次，選取其中手法壓力曲線均值較接近的5組為樣本并取其平均值；再取其平均值作為手法治療的標準操作值。手法操作時，全部治療組手法壓力均值控制在以上標準操作值不超過±5%[2]。經過上述模擬測試后，選取150 mN的壓力值作為該手法的壓力。

1.4 干預方法

1.4.1 穴位定位

采用比較解剖學和模擬人體經穴定位法結合進行新西蘭兔穴位定位[6]。中脘穴：取家兔胸骨下端和肚臍之間連線的中點；天樞穴：取肚臍與腹外側之間連線上內1/3與外2/3的交點。

1.4.2 手法操作

(1)由兩名助手將家兔固定于手術臺上，腹部向上，剃毛后定好穴位。(2)電腦進入壓力監測界面，且設定機械臂操作頻率為101～150次/min。(3)在家兔腹部固定好壓力傳感器。(4)使用人工智能機械臂于中脘、天樞(雙)行一指禪推法，操作時觀察電腦顯示的壓力曲線變化以保證手法力量與波形穩定，操作后保存壓力曲線記錄。每穴推5 min，每次治療時長為15 min，每天1次，連續10 d。其中I組家兔在每日治療結束后注射ML-9(2 mg/kg)，抑制MLCK靶點，持續干預10 d。

1.5 血清胃泌素(GAS)水平測定

胃泌素采用家兔血清樣本提取。血清樣本處理如下：采血得到血液后靜置使其自然凝固，在4 ℃下，3 000 r/min離心20 min，收集上清液即為待測血清。GAS水平測定采用ELISA法，具體步驟嚴格按試劑盒說明書進行操作。

1.6 胃竇一氧化氮(NO)水平測定

將胃內容物充分清洗干凈之后，自家兔胃幽門括約肌處取得適量胃竇部組織，并用蒸餾水沖洗干凈后用濾紙吸干多余水分，稱重，按1∶9(質量/體積)的比例，加入PBS，冰水浴條件下破碎組織得到勻漿液，4 000 r/min離心15 min，取上清液。蛋白濃度測定采用考馬斯亮藍法，以硝酸還原酶法測定組織勻漿上清液的NO水平，實驗操作嚴格按照試劑盒說明書進行。

1.7 統計學分析

2 結果

2.1 各組家兔GAS水平對比

結果顯示，4組GAS水平結果均為正態分布，故采用對比均數進行分析。組間兩兩比較，除A組(20.66±1.71)和I組(19.96±4.40)比較差異無統計學意義(P>0.05)，其余組間比較差異均有統計學意義(P<0.05)；與K組(7.17±3.89)比較，P組、A組、I組的GAS平均水平處于較高水平，其中P組(78.82±8.32)GAS平均水平最高，而A組和I組均為接受治療后的組別，兩組的GAS水平較K組上升，較P組下降，而A、I兩組之間無顯著性差異(P>0.05)，見表1。

表1 各組家兔GAS水平比較

2.2 各組家兔NO水平對比

結果顯示，4組NO水平結果均為正態分布，故采用對比均數進行分析。組間兩兩比較，除A組(46.64±5.10)和I組(4.03±1.27)比較差異無統計學意義(P>0.05)，其余組間比較，均有顯著性差異(P<0.05)；與K組(46.64±5.10)比較，P組、A組、I組的NO水平處于較低水平，其中P組(4.03±1.27)水平最低，A組及I組的NO水平較K組下降，較P組上升，而A、I兩組之間差異無統計學意義(P>0.05)，見表2。

表2 各組家兔NO水平比較

2.3 治療前后家兔食量對比

選取治療前一天的家兔進食量與結束治療后一天的家兔進食量進行對比，驗證治療是否有效。治療前一天各組的進食量為正態分布，故采用對比均數進行比較；治療結束后一天，各組的進食量為正態分布，故采用對比均數進行比較。進行組內治療前后的進食量比較，K組及P組治療前后進食量差異無統計學意義(P>0.05)，A組及I組兩組治療后的進食量均比治療前進食量增加，且治療前后進食量有顯著性差異(P<0.05)，而A組及I組兩組進食量在治療前后差異無統計學意義(P>0.05)，見表3。

表3 各組家兔治療前后平均進食量對比

3 討論

GAS及NO對胃腸運動功能皆有不同方面的影響，分析治療后胃腸激素水平，通過對比各組胃腸激素水平及各組治療后進食量，明確一指禪手法治療脾虛證家兔模型的療效。

3.1 治療后GAS水平分析

GAS由胃竇部G細胞分泌，該激素水平變化與胃腸運動功能有密切的關系，能夠引起胃竇收縮和胃底舒張，延遲胃排空[7]。GAS對胃運動產生影響的可能機理如下：(1)GAS可與幽門上的受體相結合，經過相關生化反應激動兩個信號傳遞途徑：IP3/Ca2+和DG/PKC途徑[8]，繼而使幽門收縮。(2)GAS可間接通過內臟神經或迷走神經反射抑制胃排空[9]。由此證明，胃泌素具有減緩胃排空的作用。GAS可影響模型組家兔的胃運動功能，延長胃排空時間。造模后，P、A、I組GAS水平較K組升高，表示造模成功，經手法治療后的A組及I組GAS水平較P組都有下降，說明一指禪手法可減緩脾虛型家兔的胃竇收縮和胃底舒張，加強胃排空，進而促進家兔的胃運動功能。

3.2 治療后NO水平分析

NO是一種重要的腦腸肽，可調節平滑肌舒張性，具有抑制胃腸收縮功能的作用，亦對內臟感覺的傳導有抑制作用，在中樞及外周神經調節胃運動過程中扮演重要角色。因此當NO含量升高時，可減少降低內臟敏感性，對腹痛等癥狀有改善作用[10]。本實驗中，K組NO水平最高，P組NO水平最低，而經手法治療后的A組及I組的脾虛型家兔，其NO水平較P組都有上升，結合治療后脾虛型家兔進食量的上升，說明一指禪手法可調控NO含量，推測其可降低脾虛型家兔腹痛等不適癥狀，使治療后的脾虛型家兔進食量增加，促進胃腸攝入功能的恢復。

3.3 關于MLCK通路的討論

現代生理研究認為，在胃腸道平滑肌細胞內有兩條信號通路可控制消化道的收縮舒張運動功能，包括肌球蛋白輕鏈激酶(MLCK)和蛋白激酶C(PKC)兩條途徑，而MLCK通路的作用更為突出，常與鈣離子濃度相關。本實驗A組及I組均為一指禪手法治療組，而I組注射了ML-9(MLCK抑制劑)。實驗結果提示，A組及I組兩組的胃泌素及NO水平比較差異皆無明顯統計學意義，即不能證明一指禪手法治療對MLCK具有影響性。目前研究認為胃腸道平滑肌細胞內具有不同的通路，MLCK通路僅為其中一條。據現代生理學研究表明，GAS可通過IP3/Ca2+和DG/PKC通路影響胞內鈣離子濃度[8]，從而影響胃腸運動功能，因此抑制MLCK通路并未影響一指禪手法通過其他通路影響相關胃腸激素，如NO及GAS，從而對胃腸平滑肌的收縮舒張產生作用。

4 小結

在本實驗中，治療后脾虛型家兔的相關胃腸激素含量較治療前有所變化，但仍未恢復至正常家兔的水平，說明一指禪推法治療后，家兔受損的胃腸功能可得到一定程度的恢復。此外，通過實驗結果可得知，盡管現有藥理學研究證據表示MLCK通路途徑為主導，但本實驗暫未發現一指禪推法與MLCK通路存在對應關系。由于消化道平滑肌內存在多條通路，如張鋒利等[11]研究表明桔梗枳殼湯加味可通過抑制PI3K/Akt通路調節胃腸激素，增強胃腸動力。這也說明一指禪治療手法亦可作用于其他通路(如IP3/Ca2+和DG/PKC)，使胃腸運動的相關激素如GAS的水平產生變化；NO亦屬于常見的神經遞質，與GAS一樣亦可通過神經—體液系統使胃腸道平滑肌進行收縮舒張運動。駱雄飛等[12]通過腹部推拿干預便秘型腸易激綜合征家兔，探討推拿手法對ENS-ICC-SMC網絡神經遞質的作用，發現推拿力可轉化成機械波影響腸道神經元。結合本次實驗結果，亦可說明一指禪推法可能通過神經-體液系統對胃腸功能產生影響，最終對脾虛型家兔起到治療作用，有待下一步實驗探究。綜上可得出，一指禪推法可通過多通路、多途徑影響脾虛型家兔的胃腸運功，并促使其胃腸功能趨于正常。