加味柴芍六君湯減輕炎癥反應在缺氧誘導的慢性萎縮性胃炎胃黏膜損傷中的保護作用研究

洪銀潔，涂文玲，傅頤，陳靜怡，朱景茹，甘慧娟，李旻

(福建中醫藥大學，福建 福州 350122)

慢性萎縮性胃炎(chronic atrophic gastritis，CAG)是以固有層腺體萎縮為主要病理特點的消化系統常見病，是“炎癌轉化”的關鍵環節。中醫學依據癥候表現將其歸屬于“胃痛”“胃痞”“嘈雜”等，CAG病機以本虛標實為根本，脾胃虛弱為本，胃絡瘀血為標，瘀血亦是CAG發生發展的重要因素[1]。IL-1β、IL-6屬于促炎細胞因子[2]，與CAG的“炎癌轉化”進展密切相關，在檢測炎癥和評估CAG病情進展方面具有重要參考價值。HIF-1α表達水平與細胞缺氧程度呈正相關[3]，CAG病久入絡，胃絡血運不暢，瘀血內阻，形成炎癥局部缺氧環境。加味柴芍六君湯在疏肝理氣、健脾和胃基礎上，加入丹參、莪術兩味中藥，兼顧活血祛瘀之效，能顯著改善臨床癥狀并促進炎癥修復[4-6]，然而其逆轉CAG胃黏膜病理改變的分子機制尚未完全闡明。本研究應用加味柴芍六君湯治療CAG模型大鼠，通過HIF-1α表達變化以及IL-1β、IL-6含量來探討加味柴芍六君湯逆轉慢性萎縮性胃炎大鼠胃黏膜病理改變的炎癥相關生物學機制，可以進一步明確疏肝健脾化瘀治療CAG的效果，為相關研究提供參考。

1 材料

1.1 動物

20只SPF級SD大鼠，雄性，體質量100～120 g，由上海斯萊克實驗動物有限責任公司提供，許可證號：SCXK(滬)2019-0005，飼養于福建中醫藥大學SPF級動物實驗中心，屏障環境下，控制環境溫度21～24 ℃，空氣濕度50%～60%。動物實驗過程符合《關于善待實驗動物的指導性意見》的相關規定，并取得福建中醫藥大學倫理委員會批準。

1.2 藥物

加味柴芍六君湯組成包含柴胡6 g，白芍4.5 g，人參9 g，白術9 g，茯苓9 g，半夏4.5 g，陳皮3 g，炙甘草6 g，丹參9 g，莪術9 g，中藥飲片均購于福建中醫藥大學附屬第三人民醫院藥劑科。浸泡30 min后單蒸水煎煮2次，混合后濃縮至含生藥量0.69 g/mL的中藥煎液，經潔凈紗布過濾后分裝，4 ℃保存備用。

1.3 試劑

脫氧膽酸鈉，批號20201209，北京奧博星生物技術有限公司；25%～28%氨水，批號202008011，西隴科學股份有限公司；HE染色試劑盒，批號J21D10Y106492，上海源葉生物科技有限公司；大鼠白細胞介素-1β(IL-1β)、白細胞介素-6(IL-6) ELISA試劑盒，批號LOT20210510A，上海酶聯生物科技有限公司；RNA提取試劑盒，批號R401-01，Vazyme；逆轉錄試劑，批號AKF1919A，寶生物工程(大連)有限公司；PCR試劑，批號AK41790A，寶生物工程(大連)有限公司。

1.4 儀器

RM2245型半自動輪轉式切片機(德國Leica公司)；5424R型高速冷凍離心機(德國Eppenddorf公司)；TissueLyser Ⅱ型組織研磨儀(Giagen公司)；RT6100型酶標儀(Rayto公司)；Nanodrop 2000型紫外-可見分光光度計(美國Thermo Scientific)；QuantStudio6 Flex型熒光定量PCR儀(美國ABI公司)。

2 方法

2.1 動物分組及造模

將大鼠適應性喂養1周后按隨機數字表法分為正常組6只，造模組14只。造模方法參照文獻[7]加以改進，將脫氧膽酸鈉粉末溶于單蒸水中配成8.29 g/L的脫氧膽酸鈉溶液，將氨水溶于單蒸水中配制成3.78 mL/L的氨水溶液，用以造模組大鼠每日交替飲用，并配合饑飽失常(兩日飽食，一日停食)，循環往復，共16周。造模結束后隨機取2只造模組大鼠取材觀察胃黏膜組織病理形態，若出現固有層腺體萎縮，炎性細胞浸潤則提示造模成功。將成模大鼠隨機分為模型組、加味柴芍六君湯組，每組6只。

2.2 給藥

按人與動物間藥物劑量換算的常規算法[8]，大鼠的給藥量約為人的6倍，正常組和模型組予等體積(10 mL/kg)生理鹽水灌胃，加味柴芍六君湯組予0.69 g/mL加味柴芍六君湯灌胃，每日1次。3組均連續干預4周。

2.3 取材

灌胃結束后，大鼠禁食不禁水24 h，稱取大鼠體質量，用20%烏拉坦(0.3 mL/100 g)腹腔注射麻醉，麻醉后迅速剖腹，行腹主動脈采血。斷頭處死大鼠，取出全胃并從幽門處沿胃大彎剪開胃腔，冰生理鹽水清洗干凈胃內容物，取胃竇部修剪為5 mm×5 mm的組織塊放入4%的多聚甲醛溶液固定24 h，其余胃黏膜組織置于凍存管，-80 ℃儲存備用。

2.4 觀察及檢測指標

2.4.1 動物一般情況及體質量

觀察各組大鼠毛發色澤、精神狀態、活動度、糞便性狀等一般情況變化，并于造模前后、干預后分別記錄3組大鼠體質量。

2.4.2 HE染色法觀察胃黏膜組織病理

將4%多聚甲醛固定后的胃黏膜組織取出，梯度脫水、透明、浸蠟、石蠟包埋、連續切片，切片厚度為4 μm，撈片后烘干脫蠟，進行HE染色，封片，光學顯微鏡下觀察各組大鼠胃黏膜組織病理形態。

2.4.3 酶聯免疫吸附測定IL-1β、IL-6含量

按照ELISA試劑盒說明配制標準品和樣品，用酶標儀測定450 nm處標準品的濃度及吸光度值并繪制標準曲線。將樣品吸光度值代入標準曲線，計算各樣品中IL-1β、IL-6的實際濃度。

2.4.4 qPCR法檢測胃黏膜HIF-1α mRNA表達

將組織從-80 ℃冰箱取出冰上解凍，稱取50 mg胃黏膜組織進行RNA提取，經75%乙醇清洗后用紫外-可見分光光度計測RNA濃度。根據逆轉錄試劑說明書配制反應體系，設置逆轉錄反應條件。將反應完的cDNA吸取1 μL用于下一步的qPCR反應，其余放入-20 ℃儲存。按說明書配制qPCR反應體系，置于熒光定量PCR儀中進行擴增反應，擴增條件：95 ℃ 30 s、95 ℃ 10 s、60 ℃ 30 s，40個循環。采用β-actin作為內參基因，用2-△△Ct法計算胃黏膜HIF-1α mRNA相對表達量。引物序列見表1。

表1 胃黏膜組織β-actin、HIF-1α mRNA引物序列

2.5 統計學方法

3 結果

3.1 模型評價

3.1.1 動物一般情況及體質量比較

正常組大鼠毛發潔白有光澤，活潑好動，行動敏捷，大便性狀氣味無殊；模型組大鼠毛發粗硬，色淡黃無光澤，無精打采，安靜扎堆，大便時干時稀，氣味臭穢；加味柴芍六君湯組大鼠毛發情況、精神狀況、活動度、大便性狀等較模型組有明顯改善。造模前，正常組與造模組大鼠體質量無明顯差異(P>0.05)。造模后，與正常組相比，造模組大鼠體質量顯著減輕(P<0.01)，見表2。連續干預4周后，計算各組大鼠的體質量增量。與正常組相比，模型組大鼠的體質量增量下降(P<0.05)。與模型組相比，加味柴芍六君湯組大鼠的體質量增量顯著增加(P<0.01)，見表3。

表2 兩組大鼠造模前后體質量比較

表3 各組大鼠體質量增量比較

3.1.2 胃黏膜組織病理比較

正常組大鼠胃固有層腺體排列整齊，未見腺體萎縮、減少；模型組大鼠胃黏膜固有層腺體排列紊亂，局部腺體萎縮、減少，腺腔增大，炎性細胞浸潤，可見多處散在出血點；與模型組相比，加味柴芍六君湯組大鼠腺體排列較整齊，腺體萎縮改善，仍可見散在出血點。如圖1所示。

圖1 各組大鼠胃黏膜組織HE染色病理圖(×400)

3.2 各組血清IL-1β、IL-6含量

與正常組相比，模型組大鼠血清炎癥因子IL-1β、IL-6含量顯著升高(P<0.01)；與模型組相比，加味柴芍六君湯組大鼠血清炎癥因子IL-1β、IL-6含量顯著降低(P<0.01)。見表4。

表4 各組大鼠血清IL-1β、IL-6含量比較

3.3 各組胃黏膜HIF-1α mRNA表達

與正常組相比，模型組大鼠胃黏膜組織HIF-1α mRNA表達量明顯上調(P<0.05)；加味柴芍六君湯組大鼠胃黏膜組織HIF-1α mRNA表達量與模型組表達量相比有下調趨勢，差異無統計學意義(P>0.05)，見表5。

表5 各組大鼠胃黏膜組織HIF-1α表達水平比較

4 討論

CAG歸屬于中醫學“胃痛”“胃痞”“嘈雜”等范疇，中醫學認為，CAG病位在胃，與肝、脾密切相關，肝與脾在生理上密切相關，病理上相互影響[9-10]。“土得木而達”，脾土得肝木之疏泄，脾胃升降協調，運化功能健旺；而“木賴土以培之”，脾為氣血生化之源，脾氣運化水谷精微，輸送滋養肝木，才能發揮其正常的生理功能。血液的生成和循行同樣需要肝脾相互協作，脾氣健運，氣血化源充足，肝血充足，則疏泄正常，氣機調暢，氣血運行方能無阻。葉天士在《臨證指南醫案》中指出慢性遷延性疾病的發生發展規律是“初為氣結在經，久則血傷入絡”，CAG病程長，病情反復，血瘀是CAG病情進展的關鍵因素[11-12]，肝郁脾虛是CAG的重要病理特點，而柴芍六君湯是臨床上治療慢性萎縮性胃炎肝郁脾虛型的常用方劑。本研究在柴芍六君湯的基礎上加入活血祛瘀、通經止痛之丹參以及破血行氣、消積止痛之莪術組成加味柴芍六君湯，旨在探討加味柴芍六君湯針對肝郁脾虛血瘀病機治療CAG的炎癥相關生物學機制。

本實驗通過動物一般情況、體質量以及胃黏膜組織病理形態比較來進行模型評價。結果顯示，模型組大鼠毛發粗硬，色淡黃無光澤，無精打采，安靜扎堆，大便時干時稀，氣味臭穢，成模大鼠體質量較正常組大鼠顯著減輕，其宏觀表征符合肝郁脾虛的病機特點。模型組大鼠胃固有層腺體萎縮，符合CAG的病理診斷標準，說明CAG疾病模型已成功建立。

IL-1β是由單核-巨噬細胞分泌的炎癥因子，能引發級聯反應致使白細胞聚集、浸潤，放大炎癥反應，并通過影響炎癥與免疫二者平衡[13-14]，促進腫瘤的發生發展。其能誘導內皮細胞活化，在CAG胃黏膜炎癥反應中起調節作用，但IL-1β水平過高會損傷胃黏膜。研究顯示[15]，IL-1β水平在慢性非萎縮性胃炎、慢性萎縮性胃炎、胃癌3個階段有顯著差異，呈升高趨勢，并與胃癌的生長、浸潤及轉移明顯相關。血清IL-6是可調節免疫細胞(B細胞和T細胞)參與機體免疫應答，促進炎癥反應的一種多效炎癥細胞因子[16]。較多研究表明[17-18]，IL-1β、IL-6在炎性反應的發生發展過程中起重要作用，可用于探討胃黏膜損傷的嚴重程度及炎癥分級。

HIF-1α是對缺氧水平產生細胞免疫應答的主要調節因子，可以激活多種缺氧反應基因的表達，其在常氧環境下不穩定，易被細胞內氧依賴性泛素蛋白酶降解，但在缺氧環境下可以穩定表達[19]。缺氧是腫瘤微環境的一個常見特征，可誘導HIF-1α表達水平上調，增強腫瘤細胞對低氧環境的適應能力[20]，增加CAG的癌變風險。

本實驗研究結果顯示，模型組血清IL-1β、IL-6含量顯著升高，胃黏膜組織HIF-1α mRNA表達水平較之正常組上調，表明CAG胃黏膜損傷程度較為嚴重，炎癥反應明顯，胃黏膜局部缺氧環境形成，癌變風險增加。加味柴芍六君湯干預后IL-1β、IL-6含量顯著減輕，HIF-1α mRNA表達水平較模型組表現出下調的變化趨勢，說明藥中病機，能促進CAG胃黏膜損傷修復，減輕炎癥反應，可能具有改善胃黏膜缺氧環境的作用，但效果不甚明顯。

綜上所述，加味柴芍六君湯可能是通過降低血清IL-1β、IL-6含量，下調胃黏膜缺氧誘導因子HIF-1α過表達，從而改善胃黏膜局部缺氧環境，減輕炎癥反應，逆轉胃黏膜萎縮。