經典名方保陰煎HPLC指紋圖譜的建立及多成分含量測定方法研究

張曼，李秋晗，謝靜，王佳慧，吳修紅，閆廣利，李丹，王喜軍*

(1.黑龍江中醫藥大學 教育部經典名方有效性評價及產業化開發工程研究中心，黑龍江 哈爾濱 150040；2.京津冀聯創藥物研究(北京)有限公司，北京 100025)

保陰煎源于明代張景岳著《景岳全書》，由生地黃、熟地黃、白芍、黃柏、黃芩、川續斷、山藥和甘草組成，具有滋陰清熱、固沖止血的功效，現代臨床用于治療月經病[1-4]、妊娠病[5-7]、產后病[8-9]、婦科雜癥[10-12]等,療效確切。保陰煎現收錄于國家中醫藥管理局發布的《古代經典名方目錄(第一批)》，可按照現行中藥注冊3.1類新藥要求通過簡化注冊程序研發古代經典名方保陰煎復方制劑。

按照古代經典名方復方制劑的研發要求，首先需研究制定經典名方基準樣品的質量標準，作為參照標準，優化確定制劑生產工藝和制劑質量標準，保障與傳統湯劑安全性和臨床療效的一致性。經典名方基準樣品的質量評價，需要綜合考慮藥材-飲片-基準樣品-制劑的相關性以及與臨床療效的相關性，采用指紋圖譜或特征圖譜、多成分含量測定等整體控制方式。本研究前期利用中醫方證代謝組學技術篩選了保陰煎治療功能性子宮出血的藥效物質基礎，發現5-羥甲基糠醛、小檗堿、黃芩苷、芍藥苷與功能性子宮出血生物標志物高度關聯，是保陰煎表達臨床療效的潛在藥效物質基礎[13]。5-羥甲基糠醛來源于君藥地黃，具有抗氧化[14]、降低雌二醇及孕酮含量和抑制排卵[15]等藥理作用；芍藥苷來源于臣藥白芍，具有鎮痛[16]、抗炎[17]、抗抑郁[18]等藥理作用；小檗堿來源于臣藥黃柏，具有抗菌抗炎、降血壓[19]等藥理作用；黃芩苷來源于佐藥黃芩，具有抗炎、抗氧化、抗抑郁、抗腫瘤等[20]藥理活性。因此，本研究利用高效液相色譜法建立保陰煎基準樣品的指紋圖譜，并參照中藥質量標志物屬性[21]，選擇5-羥甲基糠醛、小檗堿、黃芩苷、芍藥苷4個與療效相關且體現配伍的指標成分建立同時含量測定方法，為經典名方保陰煎基準樣品質量標準的制定提供方法。

1 儀器與材料

1.1 儀器

高效液相色譜儀-光電二極管陣列檢測器(e2695-2998，美國Waters公司)；十萬分之一電子分析天平(CP-225D，德國SARTORIUS公司)。

1.2 試藥

5-羥甲基糠醛對照品(批號：111626-201912，含量以99.2%計)、芍藥苷對照品(批號：110736-202044，含量以96.8%計)、鹽酸小檗堿對照品(批號：110713-202015，含量以85.9%計)、黃芩苷對照品(批號：110715-201720，含量以93.5%計)、沒食子酸對照品(批號：110831-201605，含量以98.5%計)、甘草苷對照品(批號：111610-201607，含量以96.8%計)、綠原酸對照品(批號：110753-201817，含量以96.8%計)、鹽酸黃柏堿對照品(批號：111895-201805，含量以94.9%計)、黃芩素對照品(批號：111595-201808，含量以97.9%計)等，均購于中國食品藥品檢定研究院；色譜級乙腈、甲醇，美國DIKMA公司；水為超純水。

保陰煎基準樣品：取日劑量保陰煎處方飲片，按古籍記載方法制備煎液，煎液冷凍干燥，即得。保陰煎處方飲片所用藥材分別采購自3產地，每個產地5批次，具體藥材來源見表1。

2 實驗方法與結果

2.1 指紋圖譜研究

2.1.1 色譜條件

色譜柱為DIKMA Spursil C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，流動相為乙腈(A)- 0.1%磷酸水(B)，線性梯度洗脫程序：0～10 min，2%～10%乙腈；10～40 min，10%～14%乙腈；40～55 min，14%～18%乙腈；55～75 min，18%～30%乙腈；75～85 min，30%～60%乙腈；85～95 min，60%～90%乙腈；95～100 min，90%～95%乙腈。流速為1.0 mL/min，檢測波長為230 nm，柱溫為25 ℃，進樣體積5 μL。

2.1.2 供試品溶液的制備

取基準樣品約1 g，精密稱定，置于具塞錐形瓶中，加入甲醇和無水乙醇(1∶1)混合溶劑20 mL，密塞，稱定重量，超聲處理(功率250 W，頻率40 kHz)30 min，放冷，再稱定重量，用溶劑補足失重，搖勻，濾過，取續濾液，即得。

2.1.3 方法學考察

2.1.3.1 精密度試驗

取基準樣品，按2.1.2項下方法制備保陰煎供試品溶液，連續測定6次，采集指紋圖譜，選擇芍藥苷作為參比峰，各峰的相對保留時間及相對峰面積RSD均<3.0%，結果表明，該儀器的精密度良好，符合指紋圖譜要求。

2.1.3.2 穩定性試驗

取基準樣品，按2.1.2項下方法制備保陰煎供試品溶液，分別于制備后0、3、6、9、12、18、24 h進樣采集HPLC色譜圖，選擇芍藥苷作為參照峰，計算共有峰的相對保留時間及相對峰面積，計算RSD。指紋圖譜共有峰在24 h內的相對保留時間RSD值<1.2%、相對峰面積RSD值<3.0 %，表明24 h內供試品溶液具備良好的穩定性。

2.1.3.3 重復性試驗

取基準樣品，按照2.1.2項下方法平行制備6份供試品溶液，測定HPLC色譜圖，選擇芍藥苷作為參照峰，記錄共有峰的相對保留時間和相對峰面積。結果指紋圖譜中的相對保留時間RSD值均<1.0%，共有峰相對峰面積RSD值均<3.0%，說明該方法具備良好的重復性。

2.1.4 保陰煎指紋圖譜的建立

2.1.4.1 指紋圖譜相似度計算

取15批保陰煎基準樣品，按照2.1.2項下方法制備供試品溶液，按照2.1.1項下方法測定HPLC色譜圖，見圖1。將得到的各批次基準樣品指紋圖譜輸入“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(2012.130723版)”，進行多點校正和匹配，得出保陰煎基準樣品對照指紋圖譜，見圖2。確定20個共有峰并記錄峰面積，計算相似度，結果見表2。15 批保陰煎基準樣品指紋圖譜與其生成的對照指紋圖譜的相似度均>0.9，說明15批飲片制備的基準樣品質量基本一致。為保障基準樣品質量，暫定保陰煎基準樣品指紋圖譜與對照指紋圖譜的相似度應>0.9。

表2 15批保陰煎基準樣品指紋圖譜的相似度評價結果

圖1 15批保陰煎基準樣品HPLC指紋圖譜

圖2 保陰煎基準樣品HPLC對照指紋圖譜

2.1.4.2 指紋圖譜共有峰的歸屬

取保陰煎基準樣品、各單味飲片及各缺味方飲片的水煎液凍干粉，按照2.1.2項下方法分別制備供試品溶液，按照2.1.1項下色譜條件采集HPLC色譜圖，見圖3。將保陰煎基準樣品HPLC指紋圖譜中各峰與飲片、缺味方的指紋圖譜進行比對，確定保陰煎基準樣品HPLC指紋圖譜中各峰的歸屬。結果顯示，在保陰煎基準樣品 HPLC指紋圖譜中1、6、8號峰來源于白芍，2號峰來源于生地黃和熟地黃，4、5、7、9、16號峰來源于黃柏，10、12、15、17、18、19、20號來源于黃芩，3、4、13、14號峰來源于續斷，4、11、14號來源于甘草。

圖3 保陰煎供試品溶液及各單味藥材、缺味方供試品溶液的HPLC色譜圖

2.1.4.3 指紋圖譜共有峰的指認

制備中藥化學對照品溶液，按照保陰煎基準樣品指紋圖譜測定方法測定HPLC色譜圖，比較保留時間和紫外吸收光譜圖，對保陰煎基準樣品20個共有峰中的12個色譜峰進行了指認，其中1號色譜峰為沒食子酸，2號色譜峰為5-羥甲基糠醛，4號色譜峰為綠原酸，5號色譜峰為黃柏堿，7號峰為木蘭堿，8號色譜峰為芍藥苷，11號色譜峰為甘草苷，15號色譜峰為黃芩苷，16號色譜峰為小檗堿，18號色譜峰為含漢黃芩苷，19號色譜峰為黃芩素，20號色譜峰為漢黃芩素，見圖4。

注:1.沒食子酸；2.5-羥甲基糠醛； 4.綠原酸；5.黃柏堿；7.木蘭堿；8.芍藥苷；11.甘草苷；15.黃芩苷；16.小檗堿；18.漢黃芩苷； 19.黃芩素； 20.漢黃芩素。圖4 保陰煎基準樣品HPLC指紋圖譜共有峰的指認

2.2 含量測定研究

2.2.1 色譜條件

色譜柱為Waters Symmetry?C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，流動相為乙腈-0.1%磷酸水，線性梯度洗脫程序：0～7 min，16%乙腈；7～8 min，16%～20%乙腈；8～10 min，20%～25%乙腈；10～20 min，25%～30%乙腈。芍藥苷、小檗堿、黃芩苷及5-羥甲基糠醛的檢測波長分別為231 nm、264 nm、277 nm、284 nm，柱溫40 ℃，流速1.0 mL/min，進樣體積10 μL。

2.2.2 對照品溶液的制備

取芍藥苷、鹽酸小檗堿、黃芩苷及5-羥甲基糠醛對照品適量，精密稱定，加甲醇分別制成每1 mL含0.90 mg、1.21 mg、1.03 mg、0.07 mg的對照品儲備液。分別精密量取上述對照品儲備液適量，置于同一容量瓶中，加甲醇定容，配制成濃度為每1 mL分別含芍藥苷、鹽酸小檗堿、黃芩苷和5-羥甲基糠醛46.99 μg、24.22 μg、171.20 μg、2.90 μg的混合對照品溶液。

2.2.3 供試品溶液的制備

稱取保陰煎基準樣品約0.1 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入75%甲醇20 mL，密塞，稱定重量，超聲處理(功率250 W，頻率40 kHz)30 min，放冷，再稱定重量，用75%甲醇補足失重，搖勻，濾過，取續濾液，即得。

2.2.4 陰性溶液的制備

按照保陰煎基準樣品的制備工藝分別制備缺地黃、缺黃柏、缺白芍、缺黃芩的保陰煎基準樣品的陰性樣品，再按2.2.3項下方法制備陰性樣品溶液。

2.2.5 方法學考察

2.2.5.1 專屬性試驗

按照2.2.1項下色譜條件測定芍藥苷、鹽酸小檗堿、黃芩苷、5-羥甲基糠醛對照品溶液、保陰煎基準樣品供試品溶液和缺白芍、缺黃柏、缺黃芩及缺地黃的陰性樣品溶液，所得HPLC色譜圖見圖5。結果顯示陰性樣品溶液在對照品峰相應位置處無干擾，各成分峰分離度良好。

注：a.對照品溶液；b.陰性對照溶液；c.保陰煎基準樣品供試品溶液;1.芍藥苷；2.鹽酸小檗堿；3.黃芩苷；4.5-羥甲基糠醛。圖5 保陰煎基準樣品多成分含量測定專屬性考察HPLC色譜圖

2.2.5.2 線性關系

取2.2.2項下制備的芍藥苷、鹽酸小檗堿、黃芩苷和5-羥甲基糠醛對照品儲備液，精密量取適量，加甲醇稀釋制成每1 mL含芍藥苷186.70 μg、鹽酸小檗堿84.60 μg、黃芩苷632.40 μg、5-羥甲基糠醛10.97 μg的混合對照品溶液，再逐級稀釋，共制得6個濃度的混合對照品溶液；取上述對照品溶液各10 μL，按照2.2.1項下的色譜條件測定其峰面積。以對照品溶液的濃度為橫坐標(x)，峰面積為縱坐標(y)，繪制標準曲線，見表3。

表3 各成分的回歸方程、相關系數、線性范圍

芍藥苷、鹽酸小檗堿、黃芩苷、5-羥甲基糠醛標準曲線的相關系數(r)均>0.999，分別在5.83～186.70 μg/mL、2.64～84.60 μg/mL、19.76～632.40 μg/mL、0.34～10.97 μg/mL濃度范圍內呈良好的線性關系。

2.2.5.3 精密度試驗

取保陰煎基準樣品，按照2.2.3制成供試品溶液，按照2.2.1項下色譜條件連續測定6次，記錄峰面積并計算相對標準差值。結果顯示芍藥苷、鹽酸小檗堿、黃芩苷、5-羥甲基糠醛峰面積的RSD值分別為1.18%、0.93%、0.93%、0.89%，表明儀器精密度良好。

2.2.5.4 重復性試驗

取保陰煎基準樣品，按照2.2.3項下制備方法制成6份供試品溶液，按照2.2.1項下色譜條件測定，記錄峰面積并計算各成分含量及相對標準差值。結果顯示芍藥苷、鹽酸小檗堿、黃芩苷、5-羥甲基糠醛平均含量的RSD值分別為0.58%、0.20%、0.23%、0.77%，表明供試品溶液制備方法重復性良好。

2.2.5.5 穩定性試驗

按照2.2.3項下方法制備保陰煎基準樣品供試品溶液，按2.2.1項下色譜條件，分別在制備后0、2、4、6、8、10、12、24 h進樣，計算芍藥苷、鹽酸小檗堿、黃芩苷、5-羥甲基糠醛峰面積的RSD值分別為0.78%、0.42%、0.39%、1.40%，表明供試品溶液在24 h內穩定。

2.2.5.6 加樣回收率試驗

取保陰煎基準樣品9份，每份約0.05 g，精密稱定，分別按已知含量的50%、100%、150%加入對照品5-羥甲基糠醛、芍藥苷、鹽酸小檗堿和黃芩苷，每個濃度設置3個平行樣品，按照2.2.3項下制備方法制成供試品溶液，按照2.2.1項下色譜條件測定，計算各成分的加樣回收率，結果顯示芍藥苷、小檗堿、黃芩苷及5-羥甲基糠醛的平均回收率范圍分別為97.63%～102.03%、98.26%～101.60%、97.30%～101.60%、87.24%～90.39%，RSD值均<3%，符合《中國藥典》要求。

2.2.6 保陰煎基準樣品的含量測定

根據上述色譜條件及供試品溶液制備方法的考察結果，本研究建立的保陰煎基準樣品中5-羥甲基糠醛、芍藥苷、小檗堿、黃芩苷的同時含量測定方法可用于多批次保陰煎基準樣品的含量測定。取15批保陰煎基準樣品，按2.2.3項下方法制備供試品溶液，再按2.2.1項下色譜條件進樣測定。記錄樣品中5-羥甲基糠醛、芍藥苷、小檗堿和黃芩苷及其隨行對照品的峰面積，按照外標一點法計算各成分含量，結果見表4。

表4 15批保陰煎基準樣品中各成分的含量

3 討論

3.1 色譜條件的優化

由于甲醇具有較強的紫外末端吸收，作為流動相在梯度洗脫中出現了顯著的基線漂移，故在保陰煎指紋圖譜檢測時選擇紫外末端吸收較弱的乙腈作為流動相的有機相。保陰煎既含有黃芩苷等酸性成分，又含有小檗堿等堿性成分，色譜分離流動相中必須添加改性劑，故對乙腈-水、乙腈-0.05%磷酸水、乙腈-0.1%磷酸水、乙腈-0.15%磷酸水的流動相組成系統進行考察。根據色譜峰的數目、峰型及分離度，可以明顯看出流動相為乙腈-0.1%磷酸水時，峰型良好且分離度良好。在210～400 nm波長范圍內采集HPLC色譜圖，對比發現，檢測波長為230 nm時，能獲得最多的峰，各峰強度均適中。

在含量測定時，采集芍藥苷、鹽酸小檗堿、黃芩苷、5-羥甲基糠醛在200～400 nm的紫外光譜圖，觀察各成分的紫外吸收特征，分別選擇芍藥苷、鹽酸小檗堿、黃芩苷、5-羥甲基糠醛在231 nm、264 nm、277 nm、284 nm的達峰波長為保陰煎中該成分的檢測波長。分別考察甲醇-0.1%磷酸水和乙腈-0.1%磷酸水的洗脫系統，結果顯示乙腈-0.1%磷酸水為流動相時分離度良好。進一步對柱溫進行考察，發現柱溫為40 ℃時各峰在其檢測波長下均能達到基線分離，峰型較好，峰面積適中。

3.2 供試品溶液制備方法考察

本實驗在建立指紋圖譜及含量測定方法時均對取樣量、提取時間及提取溶劑進行考察，優選供試品溶液制備方法。根據各成分的峰面積、峰型及分離度，最終選擇1.0 g基準樣品用甲醇-無水乙醇(1∶1)超聲提取30 min制備指紋圖譜供試品溶液，0.10 g基準樣品用75%甲醇超聲提取30 min制備含量測定供試品溶液，能夠使各峰均能獲得最優提取。

3.3 分析方法評價

本研究首先利用高效液相色譜法建立了保陰煎指紋圖譜，確定了20個共有峰，包含了保陰煎組方藥味白芍、續斷、黃芩、黃柏、甘草的特征成分。該指紋圖譜僅檢測到來自生地黃和熟地黃的5-羥甲基糠醛，也沒有發現山藥的成分，主要是由于采用紫外檢測器，一些紫外吸光系數較小的成分和含量相對很低的成分難以獲得檢測，例如地黃苷D、梓醇及山藥甾體皂苷等成分[22-23]。對于此類成分，本研究通過薄層色譜法進行了定性鑒別。

保陰煎主治一切陰虛內熱動血等證，現代文獻報道多用于先兆性流產和功能性子宮出血的治療[24-25]。本研究前期利用中醫方證代謝組學方法，闡釋了保陰煎治療功能性子宮出血的生物效應，鑒定了63個原型入血成分和10個代謝產物，其中來自生地黃和熟地黃的5-羥甲基糠酸(原型成分為5-羥甲基糠醛)、來自白芍的芍藥苷、來自黃芩的黃芩苷、來自黃柏的小檗堿，是與生物標志物高度相關的體內顯效成分，可作為保陰煎關鍵質量標志物[13]。因此，本研究在指紋圖譜分析基礎上，進一步優化色譜條件和供試品溶液制備方法，建立了這4個關鍵質量標志物的同時含量測定方法。

4 結論

本研究建立了保陰煎基準樣品HPLC指紋圖譜檢測方法，通過15批基準樣品的測定，確定了對照指紋圖譜及20個共有峰，暫定相似度大于0.9。選擇藥效相關、體現配伍的4個成分芍藥苷、鹽酸小檗堿、黃芩苷、5-羥甲基糠醛，作為保陰煎基準樣品質控成分，利用HPLC建立了同時含量測定方法。結合指紋圖譜和多成分含量測定，為保陰煎基準樣品的整體質量控制及其復方制劑的開發提供了方法。