來曲唑?qū)Ω啐g雌性SD大鼠子宮內(nèi)膜容受性、血管內(nèi)皮生長因子和內(nèi)皮型一氧化氮合酶表達(dá)的影響Δ

劉 靜，李 翠，于 倩

(1.唐山市婦幼保健院婦科，河北 唐山 063000； 2.唐山市婦幼保健院生殖遺傳科，河北 唐山 063000)

隨著社會的快速發(fā)展以及工作、生活壓力的增大，晚婚晚育已成為一種社會趨勢，但隨著年齡的增加，女性的生育能力明顯降低，不孕癥已成為亟需解決的社會學(xué)問題[1]。據(jù)報道，排卵障礙導(dǎo)致的不孕在不孕癥中所占比例為25%～30%[2]。盡管通過超促排卵可以讓高齡不孕患者得到較高的排卵率，但容易對子宮內(nèi)膜容受性產(chǎn)生不利影響，最終會導(dǎo)致不良妊娠結(jié)局[3-4]。因此，迫切需要開發(fā)新的治療方法來改善高齡不孕患者的子宮內(nèi)膜容受性。來曲唑為芳香化酶抑制劑，可以提高患有無排卵多囊卵巢綜合征的低生育力女性的妊娠率[5]。但關(guān)于來曲唑?qū)Ω啐g超促排卵模型大鼠子宮內(nèi)膜容受性的影響鮮有報道。因此，本研究通過構(gòu)建高齡超促排卵模型大鼠，主要探討來曲唑?qū)Ω啐g超促排卵模型大鼠子宮內(nèi)膜容受性的影響以及可能的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動物

60只SPF級、32周齡雌性SD大鼠購自肇慶市瑞思元生物科技有限公司，生產(chǎn)許可證號：SCXK(粵)2020-0053。30只SPF級、32周齡雄性SD大鼠購自廣州賽業(yè)百沐生物科技有限公司，生產(chǎn)許可證號：SCXK(粵)2020-0055。所有動物實驗均遵循3R原則，該研究得到我院動物倫理委員會的批準(zhǔn)。

1.2 儀器

CX33型光學(xué)顯微鏡(日本Olympus公司)；KYKY-2800B型掃描電鏡(北京中科科儀股份有限公司)；ABI 7500型實時熒光定量PCR儀(北京世紀(jì)科信科學(xué)儀器有限公司)。

1.3 藥品與試劑

來曲唑片(批準(zhǔn)文號：國藥準(zhǔn)字H19991001；批號：20201203)購自江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司；促性腺激素釋放激素激動劑(GnRH-a)、尿促性腺激素(HMG)和人絨毛膜促性腺激素(HCG)均購自馬鞍山豐原制藥有限公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(貨號：Qiagen 205111)購自上海玉博生物科技有限公司；HiScript II One Step qRT-PCR Probe Kit(貨號：Q222-01)購自南京諾唯贊生物科技股份有限公司；兔源一抗血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)(貨號：ab32152)、內(nèi)皮型一氧化氮合酶(eNOS，貨號：ab252439)均購自美國Abcam公司。

1.4 超促排卵模型構(gòu)建及分組

當(dāng)大鼠處于動情周期的第3日開始造模，在每日上午7:00通過腹腔注射GnRH-a 13.5 μg/kg，每日注射1次，連續(xù)9 d，第9日腹腔注射GnRH-a時還需按照50 IU/kg的劑量注射1次HMG，2 d后按照900 IU/kg的劑量腹腔注射1次HCG[6]。當(dāng)觀察到大鼠陰道分泌物明顯增多，且通過顯微鏡可觀察到分泌物中含有大量的無核角化細(xì)胞時，則為造模成功[7]。

將SD大鼠分為對照組、模型組、來曲唑低劑量組、來曲唑中劑量組及來曲唑高劑量組，每組12只。除對照組外，其他組均需構(gòu)建超促排卵模型。建模成功后，來曲唑低劑量組、來曲唑中劑量組和來曲唑高劑量組大鼠分別按照0.13、0.26和0.52 mg/kg的劑量灌胃來曲唑[8]；對照組、模型組大鼠灌胃等體積的0.9%氯化鈉溶液，從給藥后第1日開始，每日18:00至次日8:00將雌性、雄性大鼠按照2∶1的比例合籠，合籠后通過陰道涂片觀察雌性大鼠出現(xiàn)精蟲的時間，精蟲首次出現(xiàn)的時間記作妊娠第1日。在妊娠第6日時，麻醉大鼠后解剖腹腔，觀察子宮中胚泡著床情況，記錄大鼠胚胎著床率及平均著床胚泡數(shù)；收集子宮內(nèi)膜組織，分為兩部分，一部分固定于4%多聚甲醛中，另一部分凍存于液氮中保存。

1.5 蘇木精-伊紅染色(HE染色)檢測大鼠子宮內(nèi)膜病理變化

將固定在4%多聚甲醛中的子宮內(nèi)膜組織經(jīng)石蠟包埋后，用切片機(jī)切成5 μm厚的切片，經(jīng)HE染色后，利用光學(xué)顯微鏡觀察子宮內(nèi)膜病理變化。

1.6 掃描電鏡觀察大鼠子宮內(nèi)膜胞飲突表達(dá)

用PBS將子宮內(nèi)膜沖洗干凈，然后用2.5%戊二醛固定，經(jīng)乙醇梯度脫水、叔丁醇干燥、冷凍10 min后，真空干燥2 h，將樣本用EIKO IB-3噴金粒子鍍膜儀噴金，利用掃描電鏡觀察大鼠子宮內(nèi)膜胞飲突表達(dá)情況。

1.7 定量反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(qRT-PCR)檢測子宮內(nèi)膜中VEGF mRNA、eNOS mRNA的表達(dá)

使用Trizol試劑提取組織中的總RNA，通過逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，利用HiScript II One Step qRT-PCR Probe Kit進(jìn)行qRT-PCR反應(yīng)。以GAPDH為內(nèi)參，通過2-ΔΔCT法計算VEGF mRNA、eNOS mRNA的相對表達(dá)水平，引物序列見表1。

表1 VEGF、eNOS和GAPDH的qRT-PCR引物序列Tab 1 Primer sequence of qRT-PCR of VEGF, eNOS and GAPDH

1.8 免疫組化分析大鼠子宮內(nèi)膜中VEGF、eNOS的表達(dá)

將5 μm厚的石蠟切片常規(guī)脫蠟浸水，加入檸檬酸緩沖液，微波爐加熱進(jìn)行抗原修復(fù)。用PBS洗滌后，加入內(nèi)源性過氧化物酶封閉液孵育10 min，用PBS洗滌后用山羊血清封閉20 min，然后除去血清封閉緩沖液，分別加入一抗VEGF(1∶200)、eNOS(1∶500)在4 ℃下反應(yīng)過夜。次日，切片用二抗孵育10 min，與鏈霉親和素-過氧化物酶溶液反應(yīng)10 min，并用二氨基聯(lián)苯胺染色進(jìn)行顯色。最后，將切片用蘇木精復(fù)染并用中性樹膠封片，利用光學(xué)顯微鏡觀察，以細(xì)胞質(zhì)呈現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性表達(dá)。利用Image-Pro Plus 6.0分析系統(tǒng)分析陽性染色的光密度和面積，平均光密度值=陽性染色的光密度值/面積。

1.9 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 五組大鼠胚胎著床率、平均著床胚泡數(shù)比較

與對照組比較，模型組大鼠胚胎著床率、平均著床胚泡數(shù)顯著降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；與模型組比較，來曲唑低劑量組、來曲唑中劑量組和來曲唑高劑量組大鼠胚胎著床率、平均著床胚泡數(shù)顯著升高，且呈劑量依賴性，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表2。

表2 五組大鼠胚胎著床率、平均著床胚泡數(shù)比較(n=12)Tab 2 Comparison of embryo implantation rate and average number of implanted blastocyst among five groups of rats(n=12)

2.2 五組大鼠子宮內(nèi)膜病理變化比較

對照組大鼠子宮內(nèi)膜增生，變厚，固有層水腫，血管增加且變粗；模型組大鼠子宮內(nèi)膜發(fā)育緩慢，子宮內(nèi)膜變薄，血管較少，細(xì)胞核固縮；與模型組比較，來曲唑低劑量組、來曲唑中劑量組和來曲唑高劑量組大鼠子宮內(nèi)膜增生，變厚，固有層疏松水腫，血管數(shù)量增多，且來曲唑濃度越高，對應(yīng)的變化趨勢越明顯，見圖1。

A.對照組；B.模型組；C.來曲唑低劑量組；D.來曲唑中劑量組；E.來曲唑高劑量組A.control group; B.model group; C.LE-L group; D.LE-M group; E.LE-H group圖1 大鼠子宮內(nèi)膜病理變化(HE，×200)Fig 1 Pathological change in endometrium of rats (HE，×200)

2.3 五組大鼠子宮內(nèi)膜胞飲突表達(dá)比較

對照組大鼠子宮內(nèi)膜胞飲突大量表達(dá)，胞飲突的突起比較明顯，界限清晰，有光滑的表面，微絨毛消失；模型組大鼠子宮內(nèi)膜胞飲突較對照組顯著減少，發(fā)育遲緩，體積、大小不一致，表面有大量微絨毛存在；與模型組比較，來曲唑低劑量組、來曲唑中劑量組和來曲唑高劑量組大鼠子宮內(nèi)膜胞飲突表達(dá)增多，且來曲唑濃度越高，越接近于對照組，見圖2。

A.對照組；B.模型組；C.來曲唑低劑量組；D.來曲唑中劑量組；E.來曲唑高劑量組A.control group; B.model group; C.LE-L group; D.LE-M group; E.LE-H group圖2 大鼠子宮內(nèi)膜胞飲突表達(dá)(掃描電鏡)Fig 2 Expression of pinopode in endometrium of rats (scanning electron microscope)

2.4 五組大鼠子宮內(nèi)膜中VEGF mRNA、eNOS mRNA表達(dá)水平比較

與對照組比較，模型組大鼠子宮內(nèi)膜中VEGF mRNA、eNOS mRNA表達(dá)水平顯著降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；與模型組比較，來曲唑低劑量組、來曲唑中劑量組和來曲唑高劑量組大鼠子宮內(nèi)膜中VEGF mRNA、eNOS mRNA表達(dá)水平顯著升高，且呈劑量依賴性，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表3。

表3 五組大鼠子宮內(nèi)膜中VEGF mRNA、eNOS mRNA表達(dá)水平比較Tab 3 Comparison of VEGF mRNA and eNOS mRNA levels in endometrium among five groups of rats n=12)

2.5 五組大鼠子宮內(nèi)膜中VEGF、eNOS表達(dá)比較

VEGF、eNOS陽性產(chǎn)物主要分布在細(xì)胞漿中。與對照組比較，模型組大鼠子宮內(nèi)膜中VEGF、eNOS平均光密度值顯著降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；與模型組比較，來曲唑低劑量組、來曲唑中劑量組和來曲唑高劑量組大鼠子宮內(nèi)膜中VEGF、eNOS平均光密度值顯著升高，且呈劑量依賴性，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見圖3—4和表4。

表4 五組大鼠子宮內(nèi)膜中VEGF、eNOS平均光密度值比較Tab 4 Comparison o mean optical density values of VEGF and eNOS in endometrium among five groups of

A.對照組；B.模型組；C.來曲唑低劑量組；D.來曲唑中劑量組；E.來曲唑高劑量組A.control group; B.model group; C.LE-L group; D.LE-M group; E.LE-H group圖3 大鼠子宮內(nèi)膜中VEGF表達(dá)(免疫組化，×400)Fig 3 Expression of VEGF in endometrium of rats (immunohistochemistry, ×400)

3 討論

近年來，晚育已成為我國的趨勢，隨著三孩政策的實施，希望懷孕的高齡女性(≥35歲)逐漸增多[9]。據(jù)相關(guān)報道，女性生育力約從35歲開始顯著下降[10]。眾所周知，高齡女性的生育能力下降與卵巢功能和卵母細(xì)胞質(zhì)量下降有關(guān)[11]。然而，關(guān)于高齡女性生育能力下降是否與子宮內(nèi)膜容受性有關(guān)的研究卻很少。子宮內(nèi)膜容受性指子宮內(nèi)膜為胚胎定位、黏附、浸潤和著床提供最佳環(huán)境的一系列生理變化[12]。據(jù)報道，子宮內(nèi)膜容受性在妊娠中起著重要作用，被診斷為存在生育障礙的高齡女性，其生育障礙與子宮內(nèi)膜容受性降低有關(guān)[13]。良好的子宮內(nèi)膜容受性對于胚胎著床至關(guān)重要，超促排卵可對子宮內(nèi)膜容受性產(chǎn)生不利影響，最終造成排卵率高、妊娠率低的不良結(jié)局[14]。本研究利用GnRH-a+HMG+HCG構(gòu)建超促排卵大鼠模型，通過HE染色發(fā)現(xiàn)，對照組大鼠子宮內(nèi)膜增生，固有層水腫，血管增加且變粗；模型組大鼠子宮內(nèi)膜發(fā)育緩慢，子宮內(nèi)膜變薄，血管較少，細(xì)胞核固縮，提示模型組大鼠子宮內(nèi)膜發(fā)育滯后且存在子宮內(nèi)膜損傷。胞飲突為子宮內(nèi)膜容受性的形態(tài)學(xué)標(biāo)志物，已有研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，胞飲突參與了胚泡的黏附反應(yīng)，且胞飲突的數(shù)量與胚泡著床成正比例關(guān)系，胞飲突越豐富，妊娠率越高[15]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對照組比較，模型組大鼠子宮內(nèi)膜胞飲突數(shù)量顯著減少，發(fā)育遲緩，體積、大小不一致，大鼠胚胎著床率及平均著床胚泡數(shù)顯著降低，提示模型組大鼠存在胞飲突數(shù)量少且發(fā)育不良、胚胎著床率及平均著床胚泡數(shù)降低的現(xiàn)象。

A.對照組；B.模型組；C.來曲唑低劑量組；D.來曲唑中劑量組；E.來曲唑高劑量組A.control group; B.model group; C.LE-L group; D.LE-M group; E.LE-H group圖4 免疫組化分析大鼠子宮內(nèi)膜中eNOS表達(dá)(×400)Fig 4 Expression of eNOS in endometrium of rats by immunohistochemical analysis (×400)

來曲唑是一種非甾體、高選擇性芳香酶抑制劑，其通過抑制雌激素生物合成途徑的最后一步來阻斷雌激素合成，已被廣泛用于誘導(dǎo)無排卵性不孕癥患者的排卵和增加排卵女性的卵泡[16]。已有研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，來曲唑與克羅米芬聯(lián)合治療可顯著提高多囊卵巢綜合征患者的排卵率及妊娠率[17]；來曲唑通過改善多囊卵巢綜合征患者的子宮內(nèi)膜容受性來提高妊娠率[18]。而關(guān)于來曲唑?qū)Τ倥怕汛笫笞訉m內(nèi)膜容受性的影響鮮有報道。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與模型組比較，來曲唑低劑量組、來曲唑中劑量組和來曲唑高劑量組大鼠子宮內(nèi)膜增生，固有層疏松水腫，血管數(shù)量增多，子宮內(nèi)膜胞飲突表達(dá)增多，大鼠胚胎著床率及平均著床胚泡數(shù)顯著升高，且呈劑量依賴性，提示來曲唑可能通過增加子宮內(nèi)膜的厚度及血管數(shù)量，同時刺激子宮內(nèi)膜胞飲突的表達(dá)，來提高子宮內(nèi)膜容受性，進(jìn)而使胚胎著床率及平均著床胚泡數(shù)升高。

VEGF是在子宮內(nèi)膜新生血管形成中起關(guān)鍵作用的一種分子，子宮內(nèi)膜血流量的豐度直接影響子宮內(nèi)膜容受性，因此，VEGF被認(rèn)為與子宮內(nèi)膜容受性密切相關(guān)[19]。一項研究結(jié)果表明，VEGF可以通過促進(jìn)子宮內(nèi)膜的容受性來提高胚胎著床率[20]。該結(jié)果證實了VEGF在提高子宮內(nèi)膜容受性中的重要性。eNOS作為調(diào)控NO合成的限速酶，其活性直接影響NO水平[14]。有研究結(jié)果表明，低水平的NO可導(dǎo)致子宮內(nèi)膜血管通透性降低，而子宮內(nèi)膜血管通透性的升高則有利于胚泡的著床率[21]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對照組比較，模型組大鼠子宮內(nèi)膜中VEGF mRNA、eNOS mRNA表達(dá)水平及平均光密度值顯著降低，提示超促排卵可能影響子宮內(nèi)膜血管通透性；與模型組比較，來曲唑低劑量組、來曲唑中劑量組和來曲唑高劑量組大鼠子宮內(nèi)膜中VEGF mRNA、eNOS mRNA表達(dá)水平及平均光密度值顯著升高，且呈劑量依賴性，提示來曲唑可提高子宮內(nèi)膜容受性，使胚胎著床率及平均著床胚泡數(shù)升高，可能與VEGF、eNOS的表達(dá)升高有關(guān)。

綜上所述，來曲唑可提高子宮內(nèi)膜容受性，使胚胎著床率及平均著床胚泡數(shù)升高，可能與VEGF、eNOS的表達(dá)升高有關(guān)。然而，關(guān)于來曲唑?qū)ψ訉m內(nèi)膜容受性促進(jìn)作用的具體機(jī)制，有待后續(xù)實驗進(jìn)一步深入探究。