不同因子對白腐真菌生長的影響研究

王 敏

（阜陽職業技術學院，安徽 阜陽 236031）

我國是農業大國，大豆秸稈、玉米秸稈和油菜秸稈在我國產量大，是農業生產的殘留物。阜陽是重要的農副產品生產基地，秸稈資源豐富。大豆、玉米和油菜等農作物秸稈含有豐富的營養物質，但其化學結構復雜，不易被降解。因此，僅有少量用于生產紙張和飼料等行業，秸稈被隨意拋棄、放火焚燒秸稈現象依然很嚴重，影響人民的身體健康。這就會造成資源的浪費，增大環境污染治理難度。隨著科學研究的深入，研究者發現可以采用物理和化學方法處理降解部分秸稈，但由于實際生產成本、操作和環境污染等原因，推廣使用范圍較小。后來研究發現，秸稈中木質素也可以利用微生物進行轉化。木質素是一種大分子芳香族化合物。在木質素降解方面，白腐菌被公認是降解能力很強的微生物。胞外氧化酶的產生是降解木質素的能力的基礎。木質素降解酶系統主要有過氧化物酶和漆酶構成，其酶活性影響秸稈的降解程度。白腐真菌作為能降解木質素的微生物，受到了人們的廣泛關注。

張芳芳研究表明，玉米秸稈可以通過白腐真菌被降解，同時白腐真菌還能用于對污染水體的生物修復。我們只有了解白腐真菌的生長習性，才能充分發揮其作用，為環境的改善做出一定的作用。

白腐菌對秸稈的降解能力在很大程度上要依賴于培養條件。培養發酵的條件不同，降解秸稈能力也可能出現差異。內外環境因素影響白腐真菌的生長。培養基中碳氮源和金屬離子影響真菌代謝活動，進而影響真菌菌絲生長及降解酶的分泌量。篩選出適合的培養基有利于提高酶活性，這是白腐真菌降解秸稈和污染物的基礎。香菇、杏鮑菇、平菇屬白腐真菌，本文通過培養基的優化，觀測不同因子對白腐真菌的生長及漆酶分泌的影響，對白腐真菌降解秸稈和污染水體的修復具有一定的意義。

1.材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗菌種：平菇、香菇、杏鮑菇（學院選育）。

1.1.2 秸稈：玉米秸稈、大豆秸稈、油菜秸稈。

1.1.3 設備儀器：移液槍；高壓蒸汽滅菌器；高速離心機；隔水式電熱恒溫培養箱；超凈工作臺；電熱恒溫水浴箱；分光光度計；粉碎機；電子天平。

1.1.4 活化和發酵培養基：PDA 培養基：用于菌種保存和活化。

液體種子基礎培養基：刨皮馬鈴薯100g，切成2cm左右方塊置于鍋中，加熱煮沸15min，用紗布將汁濾于大燒杯中，濾液補水到1L。在馬鈴薯濾汁中再分別加人20g葡萄糖、蛋白胨2g、NaH2PO41.5g、MgSO40.75g、酵母粉1.5g，混勻全部溶解后補水至1L，分裝于250mL 錐形瓶中，0.15MPa、121℃高壓滅菌25min。

秸稈發酵培養基：大豆秸稈粉、玉米秸稈粉和油菜秸稈粉用以下1-6 種培養基進行試驗，添加秸稈粉量如下表1 所示。每種秸稈固體培養基中按表1 配方各加入20 克瓊脂。

表1 秸稈粉液體培養基配方

1.2 實驗方法

1.2.1 基質處理。秸稈取自阜陽潁州區周邊農家，選擇自然風干的無霉變秸稈粉碎成0.5mm 顆粒，滅菌處理，備用。

1.2.2 菌種制備及深層培養方法。從斜面試管中將菌種接種在滅菌平板培養基上，放入恒溫培養箱中培養，設定溫度為28℃，培養時間為8 天。待平板培養基菌絲占據1/2 平板后，用打孔器將直徑5mm 的接種物放入秸稈發酵培養基1-6 中進行試驗，觀察各平板上菌絲生長的均勻性。以菌絲體日平均生長量和生長勢為指標，選擇了一種較好的液體深層培養基配方。

液體深層培養：菌絲體在平板上生長后，取直徑5mm 的接種物，將五個接種塊放入添加大豆秸稈和油菜秸稈的培養基、碳源培養基和氮源培養基中，在無菌條件下，將五個接種塊放入每100ml 液體培養基中，并在28℃下以150r/min 的速度搖床12 天。每個實驗重復3 次。

1.2.3 菌絲體生物量的測定。發酵8 天后，用蒸餾水清洗真菌球上未過濾的秸稈粉，以每分鐘3000 轉的速度離心15 分鐘，然后置于65℃烘箱中干燥。用天平稱量其菌絲干重，把3 次平均值記作每種培養基的菌絲體干重量。通過菌絲體干重與培養基體積之比，計算出菌絲體生物量。

1.2.4 粗酶液的制備。在無菌條件下，每48 小時移取發酵液體。發酵液經單層濾紙過濾后，以每分鐘4000 轉離心10 分鐘，上清液為粗酶液。每個樣品分別取樣3 次。

1.2.5 漆酶(Lac)活性檢測。以3，3’-二甲基聯苯胺為底物，在比色皿中加入0.01mol L-1·的pH 值為4.0 醋酸鹽緩沖液3.4ml 和0.5ml 一定濃度的3，3-二甲基聯苯胺，混勻后加入0.1ml 稀釋酶溶液，檢測在25℃恒溫水箱反應5min 時600nm 處吸光值。將樣品在沸水中煮15min 后酶液為對照，將單位時間內吸光值的變化表示酶活變化。單位時間內每毫升OD 值改變0.01，作為一個酶活單位。

2.結果與分析

2.1 不同配方對白腐真菌生長的影響

表2 顯示了在液體培養基中添加不同量的秸稈粉培養條件下，對白腐真菌菌絲體均勻度和菌絲體生物量的影響。

表2 白腐真菌在不同培養液條件下的培養結果

本次研究中，主要抽選了大豆秸稈、油菜秸稈、玉米秸稈作為白腐真菌培養的基質。通過表2 可知，試驗所選的3 種秸稈粉添加量均有利于白腐真菌菌絲生長，尤其是當添加20g/L 大豆秸稈和20g/L 油菜秸稈培養基時，菌絲生物量是對照組的三倍。處理5 的菌絲生物量最大，培養后菌絲球大小均勻。處理5 的菌絲生物量與其他處理顯著不同。綜合分析表明，處理5 更適合三種白腐菌的液體培養。后期液體發酵培養基選用處理5 配方。

由上述實驗表明，在白腐真菌生長培養時加入一定量的秸稈粉，能為其生長提供所需的養分，對白腐真菌的生長具有一定的促進作用，從而使白腐真菌能夠更加快速的生長。白腐真菌在不同秸稈中生長狀況的差異，可能是由于不同的秸稈中所含的營養成分不同。

2.2 碳源對白腐真菌分泌漆酶的影響

碳源是真菌的碳骨架和能量來源。限制碳源不利于微生物的生長。碳源在真菌的生長中起著非常重要的作用。

本實驗研究了不同碳源對白腐菌生長的影響。以尿素為氮源，用5 個2%的碳源代替基本培養基中的葡萄糖。以蔗糖、可溶性淀粉、麩皮、纖維素和玉米粉為碳源，置于28℃培養，并于第12 天取樣測定漆酶活性。

結果表明，在選擇的碳源中，麩皮為碳源時漆酶活性最高，其次為纖維素和葡萄糖。麥麩中含有豐富的纖維素、木質素、維生素等物質，在平菇、香菇、杏鮑菇培養基中添加一定量的麩皮，能促進漆酶的分泌。這可能是由于木質素能作為漆酶的誘導劑，在一定程度上促進了漆酶的產生。因此，在培養過程中可以看到添加麩皮的培養基中漆酶活性較高。從實驗結果看，麥麩是平菇、香菇、杏鮑菇產生漆酶的較好碳源。

2.3 氮源對白腐真菌分泌漆酶的影響

本次實驗以尿素、硫酸銨、硝酸銨、酒石酸銨、酵母浸膏為不同氮源，觀測香菇、平菇、杏鮑菇在不同氮源作用下的生長情況。三種白腐真菌在各種氮源培養基中生長到12 天時進行漆酶活性測定。氮源培養基以麩皮為碳源。

圖2 中顯示，在試驗選定的幾種氮源中，當酵母抽提物為氮源時，香菇、平菇、杏鮑菇漆酶活力都達到較高值，若選NH4NO3為氮源時漆酶活力較差，這表明酵母抽提物可以作為最適合酶生產的氮源，酒石酸銨和蛋白胨也是較好的氮源，產生的酶活性與酵母抽提物差距不明顯。氮源的消耗直接影響木質素降解酶的產生，木質素降解酶是一種次生代謝酶。在自然狀態下，通常在氮源耗盡時產生。

2.4 銅離子對白腐真菌分泌漆酶的影響

漆酶的活性中心是由四個銅離子組成。銅作為漆酶蛋白的重要結構成分，不僅影響漆酶的活性和穩定性，而且是誘導漆酶產生的重要因素。

如圖3 所示，銅離子添加一定量，能提高漆酶活性，濃度增至50mg/L 以上時，會轉變為抑制漆酶合成。當Cu2+在20～40mg/L 濃度范圍時，酶活性與對照相差不明顯。這可能是因為低濃度時Cu2+只與酶表層附近的基團有結合作用，幾乎對漆酶的結構沒什么影響，對漆酶內部呼吸鏈傳遞影響不大，使得激活效果不明顯。

當Cu2+在50mg/L 時，香菇、平菇、杏鮑菇的漆酶活性相對較高。當Cu2+濃度超過50mg/L 時，這三種菌株漆酶活性反而降低了。這可能是由于酶的活性中心結合點被飽和，高濃度的Cu2+與酶的活性中心外的結合點增多，過多的結合點也會改變酶的結構，影響電子傳遞，出現漆酶從高活性狀態激活變為低活性，隨著底物消耗，酶活性出現抑制現象。銅缺乏和銅限制不利于漆酶的合成。Cu2+可能通過與漆酶中的酸性氨基酸殘基相互作用或通過影響漆酶的電荷平衡來影響漆酶活性。這可能是由于漆酶基因的轉錄需要銅離子來合成蛋白質。

3.討論

本實驗研究中分別選擇6 種不同的碳源和氮源，考察對漆酶活性影響。試驗表明，同一種酶在不同營養條件下其活性不同。在不同培養條件下，香菇、平菇、杏鮑菇分泌的漆酶活性也有差異，一方面可能是由于不同菌株具有生理上差異，另一方面可能是不同的培養體系對不同菌株木質素降解酶的分泌影響不同。因此，合理的物質配比對白腐菌的生長和木質素降解酶的分泌有著決定性的影響。

不同的因子影響著白腐真菌的不同方面，其中較為重要的就是培養基。培養基是白腐真菌得以生存發展的基礎，培養基質、碳源、氮源、金屬離子等都對白腐真菌的生長有一定的影響，只有研究好白腐真菌的影響因素，才能更好的培育白腐真菌，使之運用到更加廣泛、更需要的環境之中。木屑、腐爛的樹枝、農業廢棄物等都可以作為白腐真菌培養的原料，我們可以充分利用白腐真菌培養的容易性，對白腐真菌進行培養，使白腐真菌能更多的為保護環境而做出努力。