殼寡糖復合固體飲料對高尿酸血癥小鼠腸道微生態的調節作用研究

莊林，操俊，李月嬋，王佳麗，陳列歡，羅學剛，3*

（1.天津科技大學 生物工程學院工業發酵微生物教育部重點實驗室，天津 300457；2.新優藍健康科技有限公司，廣東 廣州 510530；3.天津市微生物代謝與發酵過程控制技術工程中心，天津 300457）

高尿酸血癥是嘌呤代謝異常引起的一種代謝紊亂疾病。由于生活水平的提高，飲食的多元化與不平衡化往往伴隨著風險，2021年我國高尿酸血癥總體患病率已達13.3%，并且發病患者平均年齡呈降低趨勢。高尿酸血癥的發生不僅與易感基因有關，同時與體內尿酸生成過多和排泄不足有關[1]。針對此類代謝紊亂性疾病，藥物治療與飲食干預往往缺一不可。治療高尿酸的傳統藥物往往伴隨著嚴重的副作用，飲食干預或將成為高尿酸血癥治療的有效手段[2]。因此，研發出適合飲食干預高尿酸血癥的食品具有十分廣闊的市場前景。

殼寡糖復合固體飲料（KSP）是以殼寡糖、海洋魚低聚肽（鵝肌肽）、櫻桃粉、茯苓粉為主要活性成分制成的復合固體飲料。其中殼寡糖由殼聚糖降解而來，已被批準為“新食品原料”[3]。殼聚糖雖然具有良好的吸附性，但難以被人體消化吸收[3]。研究表明，殼寡糖不僅具有抗菌、抗氧化、抗肥胖、抗2型糖尿病等生物活性，而且可以被腸上皮細胞吸收[4]。近年來，也有研究提示殼寡糖可能具有降低尿酸的作用[5]。鵝肌肽則被證實可以通過促進尿酸排泄緩解高尿酸血癥[6]。除此之外，有研究表明櫻桃粉的攝入可能會降低痛風風險[7]。茯苓粉則具有藥食同源性，且有研究表明茯苓水提物可以通過調節高尿酸血癥大鼠腎臟組織中尿酸轉運蛋白 1（urate transporter 1，URAT1）、有機陰離子轉運蛋白 1（organic anion transporter 1，OAT1）、有機陽離子轉運蛋白 2（organic cation transporter 2，OCT2）的表達促進尿酸的排泄[8]。

近年來腸道菌群作為科研工作者研究的熱門方向，為許多疾病的治療提供了新的思路。研究表明，腸道菌群在調節高尿酸血癥宿主內環境平衡發揮了重要作用[9]。與此同時，越來越多益生元的發現為腸道菌群干預高尿酸血癥的研究提供了新的方向。在此前的研究中，已經發現殼寡糖可以有效調節腸道菌群并影響宿主的代謝過程[10-11]，這為探究殼寡糖復合固體飲料對高尿酸血癥小鼠腸道菌群的作用研究提供了理論支持。本文通過建立高尿酸小鼠模型，利用16S rDNA高通量測序等技術探究以殼寡糖等活性成分組成的復合固體飲料對高尿酸血癥小鼠腸道微生態的影響，為研發飲食干預高尿酸血癥的食品提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

KM 小鼠：3周～4周齡，體重 20 g～24 g，SPF 級雄性，中國食品藥品檢定研究院；殼寡糖復合固體飲料：新優藍健康科技有限公司；酵母膏：北京索萊寶科技有限公司；乙酸乙酯（色譜純）、氧嗪酸鉀（分析純）：上海阿拉丁試劑有限公司；尿酸測試盒：南京建成生物工程研究所；乙酸、丙酸、丁酸、戊酸、異戊酸（均為色譜純）、別嘌呤醇：上海麥克林生化科技有限公司；硫酸（分析純）：天津市化學試劑三廠；濾膜：天津市津騰實驗設備有限公司；進樣針（Agilent 5181-1267）：安捷倫科技有限公司。

1.2 儀器與設備

全波長酶標儀（SpecturaMax190）：美國分子儀器公司；超低溫冰箱（Forma 700系列）：賽默飛世爾科技公司；臺式微量高速離心機（H1650-W）：湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司；氣相色譜儀（9001171，色譜柱型號為123-3262 DB-FFAP）：安捷倫科技有限公司；電子天平（BSA223S）：德國賽多利斯公司；恒溫磁力攪拌器（85-2型）：天津市華儀鑫達儀表有限公司；液氮罐（YDS-50B-20）：四川亞西機器有限公司；電泳儀（Tanon EPS 300）：上海天能科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 動物實驗

60只KM小鼠按體重隨機分為6組，每組10只，組間小鼠體重均一。包括正常對照組（normal control group，NC）、高尿酸血癥模型組（model group，M）、低劑量固體飲料組（low-dose group，LKSP）、中劑量固體飲料組（middle-dose group，MKSP）、高劑量固體飲料組（high-dosegroup，HKSP）、別嘌呤醇組（allopurinolgroup，AP）。普通飼料適應性喂養7 d后，模型組與給藥組小鼠灌胃10 g/（kg·d）酵母膏，腹腔注射300 mg/（kg·d）氧嗪酸鉀建立高尿酸血癥小鼠模型。造模1 h后灌胃30 mg/（kg·d）別嘌呤醇，正常對照組灌胃磷酸鹽緩沖液。KSP處理組小鼠給予含1.6%、2.6%、3.6% KSP的飼料[對應殼寡糖含量為150、250、350 mg/（kg·d）]，其余組正常飲食，均自由飲水。造模21 d后，摘眼球取血并處死小鼠，解剖取其盲腸內容物、結腸內容物置于超低溫冰箱保存備用。血液樣品3000r/min離心15min取血清，利用尿酸測試盒檢測血清尿酸（uric acid，UA）水平。

1.3.2 腸道菌群測序

取小鼠盲腸內容物，DNA提取試劑盒提取其微生物總DNA。通過聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）擴增其16SrDNA的V3+V4區。上下游特異性引物序列為338F（ACTCCTACGGGAGGCAGCAG）；806R（GGACTACHVGGGTWTCTAAT）。PCR 反應體系為高保真FastPfu聚合酶體系。PCR反應過程條件為95 ℃、3 min；95 ℃、30 s；55 ℃、30 s；72 ℃、45 s；循環數27個、72℃、10 min。2%瓊脂凝膠電泳檢測PCR產物。利用切膠回收試劑盒回收目的片段，定量后與純化的擴增產物等量混合，然后連接測序接頭，構建測序文庫，應用Hiseq2500 PE250上機測序。

1.3.3 短鏈脂肪酸測定

取100 mg小鼠結腸內容物，加入1 mL雙蒸水渦旋振蕩，13000r/min離心10min，取上清，加入100μL10%硫酸搖勻，加入1 mL乙酸乙酯渦旋振蕩5 min。振蕩結束后13 000 r/min離心10 min。取上清液過0.22 μm濾膜，置于氣相小瓶使用氣相色譜儀檢測。

1.3.4 數據統計

測序所得的原始數據預處理后，進行操作分類單位（operational taxonomic unit，OTU）聚類，計算得出每個OTU在各個樣品中的絕對豐度。利用Greengene數據庫、Krona軟件包等進行分類與豐度可視化。同時對樣品進行進一步的物種注釋、群落多樣性、群落差異和群落組成分析等。測序及數據處理平臺由上海美吉生物有限公司提供（http：//www.majorbio.com/）。其余數據處理與統計使用GraphPad Prism 5.0軟件進行，使用One-Way ANOVA進行組間差異分析，數據結果以平均值±標準差表示，當P＜0.05時認為具有統計學意義。

2 結果與分析

2.1 KSP對高尿酸血癥小鼠血清尿酸的影響

KSP對高尿酸血癥小鼠血清尿酸的影響見圖1。

由圖1可知，與NC組相比，M組血清尿酸高度顯著增加（P＜0.001）。與M組相比，AP組血清尿酸高度顯著降低（P＜0.001），HKSP組血清尿酸顯著降低（P＜0.05）。隨著KSP劑量增加，LKSP組、MKSP組、HKSP組血清尿酸與NC組相比差異逐漸減小，HKSP組小鼠血清尿酸與NC組相比差異性不顯著。因此，KSP可以緩解高尿酸血癥。

圖1 KSP對高尿酸血癥小鼠血清尿酸的影響Fig.1 The effect of KSP on the serum UA of hyperuricemia mice

2.2 KSP對高尿酸血癥小鼠腸道菌群多樣性指數的影響

在OTU水平上，KSP對高尿酸血癥小鼠腸道菌群多樣性指數的影響見表1。表中涉及的群落多樣性指數包括反映腸道菌群豐富度的Sobs指數、Chao指數、Ace指數，反映腸道菌群多樣性的Shannon、Simpson指數，以及評價測序樣本群落覆蓋率的Coverage指數。

表1 KSP對高尿酸血癥小鼠腸道菌群多樣性指數的影響Table 1 Effect of KSP on the diversity index of intestinal flora in hyperuricemia mice

由表1可知，所有組別Coverage指數均在0.998以上，證明此次樣本測序量合理，幾乎覆蓋了樣本所包含的所有菌群。與NC組相比，其他各組Sobs指數、Chao指數、Ace指數均高于NC組，證明高尿酸血癥小鼠的腸道菌群豐富度增加。其中HKSP組Sobs指數、Chao指數、Ace指數均高于M組，表明高劑量的KSP增加了高尿酸血癥小鼠的腸道菌群豐富度。Shannon指數的變化趨勢與Sobs指數、Chao指數、Ace指數類似，但Simpson指數的結果似乎與Shannon指數變化相反。推測是由于Simpson指數更加偏向于描述物種的相對豐度，而Shannon指數更加偏向于描述物種的絕對豐度。

2.3 KSP對高尿酸血癥小鼠腸道菌群的影響

2.3.1 KSP對高尿酸血癥小鼠腸道菌群組成差異的影響

KSP對高尿酸血癥小鼠腸道菌群組成差異的影響見圖2。

圖2 KSP對高尿酸血癥小鼠腸道菌群組成差異的影響Fig.2 Effect of KSP on the composition differences of intestinal flora in hyperuricemia mice

由圖2a可知，6組樣本共有OTU個數為355個。NC組含獨有OTU 8個，M組含獨有OTU 9個，LKSP組含獨有OTU 6個，MKSP組含獨有OTU 10個，HKSP組含獨有OTU 13個。這說明在OTU水平上，各組樣品腸道菌群具有相似性。影響樣本群落組成差異的潛在主成分由主坐標分析圖（principal co-ordinates analysis，PCoA）中各組代表點的距離表示，距離越遠，差異越大。由圖2b可知，在OTU水平上，NC組與M組代表點距離遠，這說明M組與NC組相比，在影響樣本群落組成差異的潛在主成分上具有明顯差異。除此之外，KSP處理組與M組代表點也存在一定距離，其中LKSP組代表點與M組代表點距離最遠，這說明相比于M組，影響KSP處理組樣本群落組成差異的潛在主成分也發生了變化，其中LKSP組變化最大。然而，AP組與M組代表點距離近，這表明AP組與M組樣本中影響群落組成差異的潛在主成分并沒有明顯差異，這與KSP處理組的結果不同。

2.3.2 KSP對高尿酸血癥小鼠腸道菌群組成的影響

KSP對高尿酸血癥小鼠門水平腸道菌群組成的影響見圖3。

圖3 KSP對高尿酸血癥小鼠門水平腸道菌群組成的影響Fig.3 Effect of KSP on flora community composition at phylum level in hyperuricemia mice

由圖3可知，各組群落豐度占比最大的四類菌門分別為厚壁菌門（Firmicutes）、擬桿菌門（Bacteroidota）、疣微菌門（Verrucomicrobiota）與放線菌門（Actinobacteriota）。與NC組相比，其他各組厚壁菌門的群落豐度占比下降，擬桿菌門的群落豐度占比升高。這說明高尿酸血癥小鼠腸道菌群中厚壁菌門的相對豐度降低，擬桿菌門的相對豐度升高，KSP與AP處理均未改善高尿酸血癥小鼠腸道菌群中厚壁菌門與擬桿菌門的豐度。與NC組相比，M組疣微菌門群落豐度升高。與M組相比，LKSP、MKSP組疣微菌門群落豐度升高，尤其是LKSP組疣微菌門豐度高于其他所有組，但HKSP組疣微菌門豐度有所下降。這說明高尿酸血癥小鼠腸道菌群中疣微菌門的相對豐度升高，高劑量的KSP可以使其相對豐度下降。相比于NC組，M組放線菌門的相對豐度下降。相比于M組，LKSP、MKSP和HKSP組放線菌門相對豐度沒有產生明顯變化，AP組放線菌門相對豐度有所升高。這說明KSP不能改善高尿酸血癥小鼠疣微菌門相對豐度的降低，而AP可以使其相對豐度升高。

KSP對高尿酸血癥小鼠屬水平腸道菌群組成的影響見圖4。

圖4 KSP對高尿酸血癥小鼠屬水平腸道菌群組成的影響Fig.4 Effect of KSP on flora community composition at genus level in hyperuricemia mice

由圖4可知，相比于NC組，M組擬桿菌屬（Bacteroides）、擬普雷沃菌屬（Alloprevotella）、普雷沃氏菌科 UCG-001（Prevotellaceae_UCG-001）、norank_f_Ruminococcaceae、norank_f_Oscillospiraceae 的相對豐 度升高。相比于M組，KSP處理組Bacteroides、Alloprevotella、Prevotellaceae_UCG-001、norank_f_Ruminococcaceae、norank_f_Oscillospiraceae相對豐度降低。這說明高尿酸血癥小鼠腸道Bacteroides、Prevotellaceae_UCG-001、norank_f_Ruminococcaceae、norank_f_Oscillospiraceae菌屬相對豐度增高，KSP可以調節其相對豐度。

相比于NC組，M組阿克曼氏菌屬（Akkermansia）的相對豐度有所升高。相比于M組，LKSP組Akkermansia的相對豐度升高，隨著KSP劑量的升高其相對豐度逐漸降低。這說明KSP可以調節高尿酸血癥小鼠腸道Akkermansia的相對豐度使其趨于正常小鼠腸道菌群組成。相比于NC組，M組乳酸菌屬（Lactobacillus）的相對豐度降低，相比于M組，KSP組Lactobacillus的相對豐度增加。這說明高尿酸血癥小鼠腸道Lactobacillus相對豐度降低，KSP可以增加其相對豐度。

2.4 KSP對高尿酸血癥小鼠短鏈脂肪酸的影響

短鏈脂肪酸在維持腸道內環境以及機體發揮免疫功能方面存在重要作用[12]。本研究檢測小鼠結腸內容物中所含乙酸、丙酸、丁酸、戊酸、異戊酸的含量。KSP對高尿酸血癥小鼠短鏈脂肪酸的影響見圖5。

圖5 KSP對高尿酸血癥小鼠短鏈脂肪酸的影響Fig.5 Effect of KSP on short-chain fatty acid（SCFA）in hyperuricemia mice

由圖5可知，與NC組相比，其余各組乙酸水平均無明顯變化。與NC組相比，M組丙酸、丁酸、戊酸、異戊酸水平呈上升趨勢，但差異不明顯。相比于M組，KSP處理組丙酸、丁酸、戊酸、異戊酸水平呈下降趨勢，且隨著KSP劑量的增加，逐漸下降至正常水平，其中HKSP組丁酸、戊酸、異戊酸的水平與M組差異顯著（P＜0.05）。這說明高尿酸血癥小鼠腸道丙酸、丁酸、戊酸、異戊酸異常升高，KSP可以改善這種增高使其趨于正常水平。

3 討論與結論

一種可治療痛風和高尿酸血癥的傳統中藥配方可以改善高尿酸血癥，同時調節高尿酸血癥小鼠腸道菌群組成的變化，尤其是可以降低Bacteroides、Alloprevotella的相對豐度[13]。在本實驗中，高尿酸血癥小鼠腸道Bacteroides、Alloprevotella相對豐度升高，KSP處理可以使其相對豐度下降，這與傳統中藥配方調節高尿酸血癥小鼠腸道菌群結果具有相似性。逍遙散與KSP均含茯苓。逍遙散可以通過調節晚期糖基化蛋白終產物的炎癥相關受體發揮抗抑郁作用，從而降低抑郁小鼠腸道Prevotellaceae_UCG-001的相對豐度[14-15]，并且Prevotellaceae_UCG-001在偶氮甲烷誘導的結腸炎小鼠腸道菌群中相對豐度也會提高[16]。本研究中，M組Prevotellaceae_UCG-001的相對豐度增加，KSP處理后其相對豐度下降，因此KSP可能通過緩解炎癥調節腸道菌群中Prevotellaceae_UCG-001的相對豐度。

Lactobacillus作為益生菌已經被廣泛應用于食品、醫藥及其他健康產業[17]。研究表明灌胃Lactobacillus可以緩解高尿酸血癥大鼠血清尿酸升高[18]，并且也有研究表明Lactobacillus在發揮降尿酸作用的同時不會產生毒性[19]。在本研究中，M組小鼠腸道Lactobacillus的相對豐度下降，KSP處理可以增加腸道中Lactobacillus的相對豐度，這說明KSP可能通過增加腸道中Lactobacillus的相對豐度發揮降尿酸作用。

短鏈脂肪酸（short-chain fatty acid，SCFA）是腸上皮細胞的重要燃料，可以影響腸道運動并增強腸道屏障功能以及宿主代謝[20-21]。本研究表明高尿酸血癥小鼠結腸內容物丙酸、丁酸、戊酸、異戊酸異常升高，KSP處理組可以緩解SCFA異常升高。這證明KSP可以調節高尿酸小鼠的代謝紊亂，且極有可能通過調節腸道屏障與短鏈脂肪酸的生成發揮降尿酸作用。

高尿酸血癥小鼠腸道菌群豐富度升高。KSP可以調節高尿酸血癥小鼠腸道菌群的組成，尤其是KSP可以降低高尿酸血癥小鼠腸道中Bacteroides、Alloprevotella、Prevotellaceae_UGG-001的相對豐度，同時增加有益菌屬Lactobacillus的豐度。除此之外，KSP可以影響高尿酸血癥小鼠短鏈脂肪酸的生成。因此，KSP不僅可以發揮降尿酸作用，還能改善高尿酸血癥小鼠腸道微生態。