發酵處理對壽眉風味物質的影響研究

馮曉雪，薄佳慧，葉興妹，肖力爭*，朱海燕*

（1.湖南農業大學 園藝學院，國家植物功能成分利用工程技術研究中心，茶學教育部重點實驗室，植物功能成分利用省部共建協同創新中心，湖南 長沙 410128；2.壽寧金花白茶科技有限公司，福建 寧德 352000）

白茶屬輕發酵茶。根據原料等級不同，白茶分為白毫銀針、白牡丹及壽眉3種。不同種類白茶滋味、香氣、生物活性及商業價值均存在較大不同[1]。其中，壽眉原料較粗老，可采制時間長，年產量大，市場價值較低，運輸及存儲損耗大，易出現滯銷等現象。因此，為推動茶產業結構進一步優化升級，茶行業提出六大茶類工藝相融合的制茶新思維，如微生物發酵技術不再局限于黑茶，逐漸應用于白茶、烏龍茶、紅茶、云南曬青毛茶及普洱生茶等不同茶類的生產加工中，且經微生物發酵后的各類成品茶在保健功效方面的研究也取得一定進展[2-6]。金花白茶便是一種將茯磚茶（黑茶）微生物發酵技術應用于以壽眉為主的白茶再加工工藝的新產品，兼具白茶和茯磚茶風味。

現階段，鮮有關于微生物發酵技術及發花工藝對白茶風味品質具體影響程度的研究，產品標準及生產標準尚未明確。故本研究以未陳放福建壽眉白茶為原料，采用噴灑茶汁渥堆發酵及手筑緊壓等前處理方法對其進行烘房微生物發酵。采用理化成分檢測及頂空固相微萃取-氣相色譜質譜（headspace solid phase microextraction/gas chromatography-mass spectrometry，HSSPME/GC-MS）聯用技術并結合感官審評對加工過程樣品進行成分檢測和分析，以期為探明白茶微生物定向發酵和發花技術提供數據支持，為提高金花白茶生物安全保障及發酵茶葉風味多元化提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

未陳放福建壽眉：福建白芽銀倉茶葉有限公司，經湖南益陽冠隆譽黑茶發展有限公司加工制成金花白茶。取同一批壽眉原料到微生物發酵結束的加工階段：原料（S1）、渥堆（S2）、烘房微生物發酵（S3）、烘房干燥即成品茶（S4）。微生物發酵過程實際包括從渥堆開始直至烘房干燥（S2～S4）3個階段。

茚三酮、蒽酮、甲醇、福林酚、三氯化鋁、氯化亞錫、濃硫酸、乙酸乙酯、草酸、碳酸氫鈉、乙醇、正丁醇（均為分析純）：國藥集團化學試劑有限公司；乙腈、N，N-二甲基甲酰胺、甲醇、冰醋酸、甲酸（均為色譜級）：上海麥克林生化科技有限公司；AccQ.TagTM：沃特世科技（上海）有限公司。

1.2 儀器與設備

高效液相色譜儀（1260LC）：美國安捷倫公司；氣相色譜-質譜聯用儀（TRACE1310-ISQ）、HP-5MS色譜柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）、TriPlusTMRSH 自動進樣器：美國賽默飛世爾科技公司；C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）：美國旭日公司；數顯恒溫水浴鍋（HH-2）：江南儀器廠；紫外可見分光光度計（UV2100）：上海尤尼柯儀器有限公司；固相微萃取裝置（50/30 μm DVB/CAR/PDMS萃取頭）：美國Supelco公司；固相微萃取瓶（15 mL）：天津奧特賽斯公司。

1.3 方法

1.3.1 茶葉加工方法

以未陳放壽眉為原料，噴灑發花茶葉茶汁進行渥堆，時長24 h；渥堆結束后對茶葉進行高溫汽蒸，使茶葉柔軟方便壓制不易碎；壓制方法采用傳統手筑壓制，選用500 g茶磚模具；壓制結束后將茶磚運送至恒溫恒濕烘房進行發花，時長12 d；干燥工序同樣在烘房中完成，時長8 d。

1.3.2 生化成分檢測

茶多酚、游離氨基酸、水浸出物含量分別按照GB/T 8313—2018《茶葉中茶多酚和兒茶素類含量的檢測方法》、GB/T 8314—2013《茶游離氨基酸總量的測定》及GB/T 8305—2013《茶水浸出物測定》測定；可溶性糖含量及黃酮含量分別采用蒽酮硫酸比色法及三氯化鋁法測定；咖啡堿、兒茶素組分、茶黃素及氨基酸組分均參考文獻[7]進行，采用高效液相色譜法測定。

1.3.3 香氣成分的萃取

稱取磨碎均勻茶樣1.00 g，放入15 mL萃取瓶中，加入10.00 μL正癸醇作為內標，對樣品的質量進行監控和對比，后加入5 mL沸水和1.8 g氯化鈉密封瓶口進行孵化。將TriPlusTMRSH自動進樣器于60℃條件下平衡5 min，保證進樣穩定性，并將萃取頭在60℃條件下孵化50 min。

1.3.4 香氣成分的解析

GC條件：HP-5MS色譜柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；以高純氦氣（純度＞99.999%）為載氣，不分流進樣，不分流時間1 min，流速1.3 mL/min，隔墊吹掃流速為5 mL/min；進樣口溫度250℃，吸附時間5 min。升溫程序：起始溫度為50℃，以8℃/min升至80℃，以2℃/min升至120℃，以5℃/min升至180℃，以10℃/min升至250℃，保持5 min。

MS條件：離子源為電子轟擊源（electron impact，EI）；離子源溫度250℃；電子能量70 eV；四極桿溫度150℃；傳輸線溫度250℃；質量掃描范圍m/z：35～500。

1.3.5 數據處理及質譜檢索

利用NIST標準譜庫對GC-MS分析得到的色譜峰信息進行串聯檢索和人工解析，取相似度80%以上的揮發性成分進行定性分析。對所有的相對峰面積數據進行標準化處理，依據各香氣成分峰面積歸一化的方法確定其相對含量。

1.3.6 感官審評方法

由6名國家一級評茶技師組成審評小組，取代表性樣品3.0 g，置于150 mL審評杯中，注滿沸水，加蓋浸泡5 min，濾出茶湯對茶湯及葉底香氣進行品質評價及評分。總分=外形得分×25%+湯色得分×10%+香氣得分×25%+滋味得分×30%+葉底得分×10%。

1.4 數據統計與分析

數據均采用3次重復試驗的平均值，采用Excel 2019、GraphPad Prims 8.0.2、Tbtools及 SPSS 19.0 軟件進行數據分析和繪圖。

2 結果與分析

2.1 發酵對壽眉感官品質影響

不同發酵階段壽眉感官品質的變化見表1。

表1 不同發酵階段壽眉感官品質的變化Table 1 Changes of sensory quality of Shoumei in different fermentation stages

由表1可知，白茶在微生物發酵過程中感官品質發生明顯變化。外形方面，壽眉色澤呈現綠褐—深綠褐—黃褐色的變化趨勢，S3及S4期間磚內金花普茂，達到良好的發花效果。隨著微生物大量繁殖及多酚類物質氧化，湯色由黃亮逐漸加深為橙紅明亮。白茶的清鮮感在渥堆后消失轉變為甜香，經微生物發酵轉變為以菌花香為主的香氣品質。滋味方面，壽眉的鮮爽感和澀感在渥堆發酵過程中明顯減弱，逐步向醇厚轉變。葉底在整個過程中始終保持柔軟狀態，同干茶變化相似的是，葉底色澤同樣由綠褐向黃褐色轉變。總體而言，壽眉經渥堆發酵后風味品質已經發生較大改變，微生物發酵結束后兼具陳白茶及茯磚茶風味品質。茯磚茶發花工藝的引入明顯改善了壽眉新茶較青澀的品質弊端，既保留了白茶的本質又賦予其獨特的菌花香。

2.2 白茶微生物發酵過程中主要滋味物質的變化分析

2.2.1 發酵對壽眉兒茶素組分及茶多酚含量的影響

兒茶素包括酯型兒茶素和非酯型兒茶素，是茶多酚的最主要組成部分，與茶湯的苦澀味密切相關。研究表明，兒茶素在黑茶微生物發酵過程中會轉化成多種物質[8]，導致兒茶素總量在微生物發酵過程中不斷下降，茶多酚受兒茶素含量變化的影響同樣呈明顯下降趨勢。不同發酵階段壽眉兒茶素組分及茶多酚含量變化見圖1。

圖1 不同發酵階段壽眉兒茶素組分及茶多酚含量變化Fig.1 Changes of catechin components and tea polyphenols content in Shoumei during different fermentation stages

如圖1（a）所示，壽眉微生物發酵過程中除簡單兒茶素EGC含量顯著上升（整體增幅為26.35%），除GCG和EC降幅較小外，其余所有組分含量均顯著下降。其中兒茶素組分中含量最豐富、活性最強的EGCG在發酵過程中極易水解生成沒食子酸[9]等物質，其相對含量在發酵過程中減小幅度最為明顯，由2.95%下降至0.65%。簡單兒茶素總量（包括EGC、D-LC、EC）受EGC影響，生成量大于消耗量，總體略有上升，增幅為2.31%。呈澀味和強收斂性的酯型兒茶素總量（包括EGCG、GCG、ECG）受濕熱和氧化作用的影響[10]下降顯著，降幅達69.70%。壽眉經微生物發酵后簡單兒茶素/酯型兒茶素的比值由0.21%顯著上升至0.71%，增長幅度高達236.71%。該變化可能是壽眉口感由苦澀轉為醇厚的重要原因[7]。

從圖1（b）可以看出，壽眉微生物發酵期間茶多酚含量呈顯著下降趨勢（p＜0.05）。S1～S2期間茶多酚含量變化較小，差異性不顯著，僅減少了3.67%；S2～S4期間茶多酚含量顯著下降，S3和S4較前一階段降幅分別為19.84%和6.49%。這是由于發酵過程促使冠突散囊菌大量繁殖，復雜多酚類物質受兒茶素水解、氧化及酶促反應的影響發生劇烈的降解反應。因此，S2～S3期間茶多酚含量降幅最大。酯型兒茶素、茶多酚含量的大幅下降以及簡單兒茶素/酯型兒茶素比值的顯著上升均有利于減輕壽眉新茶的青澀味，增強茶湯的醇厚度。

2.2.2 發酵對壽眉黃酮及茶黃素組分含量的影響

不同發酵階段壽眉黃酮和茶黃素含量變化見圖2。黃酮類物質主要由黃酮醇類和黃酮苷類物質組成，是茶葉苦澀味的主要來源之一[11]。如圖2（a）所示，與之前的研究相同[3，7]，壽眉微生物發酵過程中黃酮總量整體呈波動上升趨勢，整體增幅為5.92%。S1～S2期間黃酮總量上升了2.70%，之后到S3階段快速下降了10.49%，這是由于黃酮類物質在微生物生長繁殖分泌的胞外酶和濕熱作用下易發生水解[5]，冠突散囊菌生長越迅速，量級越大，因此對黃酮的酶促氧化作用越強。S3～S4期間，黃酮總量迅速上升至7.90%，增加了15.23%。這一結果與劉菲等[3]及薄佳慧等[7]關于白茶發花試驗結果一致，但黃酮總量為何會在加工前后出現明顯增長的機制及原因還尚未探明。未來需結合靶向代謝組學及酶活性等多種試驗對該變化進行深入研究。

圖2 不同發酵階段壽眉黃酮和茶黃素含量變化Fig.2 Changes of flavonoids and theaflavins contents in Shoumei during different fermentation stages

研究表明，茶黃素（theaflavins，TFs）具有明顯的護肝、抗癌、抗炎、抗氧化、抗菌、保護神經、保護皮膚、保護心臟、調節腸道微生物群和腎臟保護作用[12]，是影響茶湯強度、亮度和鮮爽度的關鍵物質之一。主要包括茶黃素雙沒食子酸酯（theaflavin 3，3′-di-O-gallate，TFDG）；茶黃素-3′-沒食子酸酯（theaflavin3′-O-gallate，TF-3'G）；茶黃素-3-沒食子酸酯（theaflavin 3-O-gallate，TF-3G）；茶黃素（theaflavin，TF）4 種單體。如圖2（b）所示，4種茶黃素單體的含量在壽眉整個加工過程中均大幅下降，整體降幅分別為48.00%、66.04%、43.21%以及54.67%。S3～S4期間整體降幅均較小，差異性不顯著。說明茶黃素含量可能與微生物發酵程度和冠突散囊菌的數量變化呈負相關。研究表明茶黃素與金花白茶滋味感官評分呈極顯著負相關[7]，因此，茶黃素含量的下降有利于改善壽眉茶湯的口感。

2.2.3 發酵對壽眉游離氨基酸總量及氨基酸組分的影響

不同發酵階段壽眉氨基酸組分的變化見表2。

表2 不同發酵階段壽眉氨基酸組分的變化Table 2 Changes of amino acid composition of Shoumei in different fermentation stages

在微生物發酵過程中游離氨基酸是微生物繁殖的重要氮源和碳源，受酶的影響易發生脫羧及脫氨反應轉化為其他物質；受茶葉溫濕度影響，氨基酸會與其他多酚類、糖類物質及含羧基化合物發生美拉德或席夫堿縮合反應生成色素、生物堿等物質[10，13-14]。如表2所示，游離氨基酸經發酵后含量顯著下降了24.91%。本次試驗共測定出17種氨基酸組分，包括茶葉中特有且含量最豐富的茶氨酸，7種必需氨基酸和9種非必需氨基酸。微生物發酵后壽眉各氨基酸組分均出現不同程度下降，其中蛋氨酸含量變化較小，差異不顯著；茶氨酸含量在整個過程中下降了28.87%，但占所測得17種氨基酸組分總量的比例上升了30.13%。必需氨基酸占非必需氨基酸的比例不斷上升，由S1的36.56%顯著上升至S4的54.80%。

2.2.4 發酵對其他滋味物質的影響

除了主要滋味物質（包括茶多酚、兒茶素、黃酮、茶黃素、氨基酸等），水浸出物、可溶性糖、咖啡堿及沒食子酸（gallic acid，GA）同樣對茶湯濃厚、甜醇口感的形成具有重要作用。發酵對其他主要滋味物質含量的影響見表3。

表3 發酵對其他主要滋味物質含量的影響Table 3 Effect of fermentation on the content of other main flavor substances

由表3可知，壽眉微生物發酵前后水浸出物和可溶性糖含量變化均較小，分別降低了6.26%和18.77%。水浸出物在發酵過程中會與茶多酚、咖啡堿和可溶性糖等形成絡合物[15]，因此導致水浸出物在一定程度上有所減少。微生物發酵過程中冠突散囊菌會大量利用茶葉中的多糖類物質為碳源進行生長繁殖，同時氨基酸類物質開始與糖發生反應形成某些香氣成分[16]，因而促使壽眉可溶性糖在渥堆階段便開始被大量消耗。

壽眉于微生物發酵過程中，咖啡堿含量不斷波動上升，增長了7.83%。S3階段咖啡堿含量最高，這是由于咖啡堿含量的增加依賴于霉菌的生長[17]。S2～S3期間是冠突散囊菌大量繁殖的高峰階段，因此咖啡堿含量隨微生物發酵加深而顯著上升[18]。GA是黑茶中含量最豐富的酚類化合物，同時也被認為是日本粉末綠茶中的一種增強鮮味的化合物[19]。該物質能夠抑制人腦膠質瘤細胞活力、增殖、侵襲和血管生成[20]。壽眉經微生物發酵后，沒食子酸含量增加幅度高達96.08%。這主要是由微生物發酵過程促進了單寧類物質水解[21]和酯型兒茶素快速降解[9]所致。

2.3 白茶微生物發酵過程中揮發性組分及相對含量的變化

茶葉中的芳香物質是決定茶葉品質的重要因子之一[22]。受茶樹品種、鮮葉原料、栽培環境、加工工藝和貯藏環境等因素的影響，清香、鮮香、青香、嫩香、花香、陳香和菌花香等香氣品質均可在白茶類產品中體現[7，23-24]。本研究采用HS-SPME法收集加工階段茶樣揮發性物質，并通過GC-MS技術鑒定出142種揮發性成分。其中醇類31種、酯類26種、碳氫類25種、酮類22種、醛類17種、酸類6種、酚醚類3種、雜環類物質5種以及其他7種物質。不同發酵階段各類揮發性成分相對含量的變化見表4。

表4 不同發酵階段各類揮發性成分相對含量的變化Table 4 Changes of relative contents of volatile components in different fermentation stages

醇類、酯類和雜環類物質含量在發酵過程中始終保持較高含量。研究表明，后發酵工藝可改變香氣組分的含量，不同的后發酵時間可能會對香氣組分產生不同的積累或消耗作用[25]。本研究所檢測出的142種香氣組分中44種具有明確的香氣特征定性結果，結合相對定量分析，S4具有明確香氣特征的物質貢獻率比S1高10.83%，說明壽眉經過發酵過程可以豐富其香氣及香型。發酵對加工中共有揮發性組分的影響見圖3。

圖3 發酵對加工中共有揮發性組分的影響Fig.3 Effect of fermentation on common-owned volatile components during process

如圖3所示，142種揮發性物質中有31種存在于整個加工過程中。31種物質具有相同的變化趨勢，其中15種在微生物發酵后相對含量顯著增加（增幅1.22%～1 033.33%），分別為香葉醇（玫瑰花香）、呋喃型芳樟醇氧化物（木香花香及樟腦氣息）、苯乙醇（弱玫瑰香）、苯甲醇（溫和芳香，苦杏仁香）、水楊酸甲酯（冬青藥草香）、橙花醇（玫瑰香）、咖啡堿、苯甲醛（杏仁氣味）、α-松油醇、N-乙基琥珀酰亞胺（增幅達1 033.33%）、十四烷、十五烷、十六烷、醋氨酚、柏木腦（柏木香）。15種在微生物發酵后相對含量逐漸降低，分別為芳樟醇（花香）、β-紫羅酮（紫羅蘭香，木香）、2，2，6-三甲基-6-乙烯基四氫-2H-呋喃-3-醇、β-環檸檬醛（清涼香和果香）、苯乙醛（甜花香）、A-紫羅蘭酮（木質紫羅蘭氣味）、癸醛（強烈橘皮氣味）、2，5-辛二酮、甲基庚烯酮（檸檬草氣味）、γ-壬內酯（椰子香、果香）、2，4-二叔丁基苯酚、棕櫚酸、棕櫚酸甲酯、3-甲基十五烷、二氫獼猴桃內酯。植酮含量發酵前后均為0.16%。31種共有組分整體增加量（19.74%）高于減少量（12.41%）。

從以上各階段共有揮發性成分相對含量的動態變化可以看出，微生物發酵后具有明確呈（清）涼香、花香及果香的香氣組分含量顯著降低了14.36%。明確呈木香、陳香、藥香及苦杏仁香香氣組分增加了89.54%。研究表明，芳樟醇、苯乙酮和水楊酸甲酯等是“菌花香”形成的關鍵香氣成分[26]。表現為木香的醇類物質（如芳樟醇氧化物）對普洱生茶陳香品質有較好的協調作用，且陳香普洱茶水楊酸甲酯的含量顯著高于普通普洱[27]。本研究中，S4較S1芳樟醇氧化物及水楊酸甲酯分別由6.90%和1.90%增加至7.26%和9.69%，水楊酸甲酯的增幅高達410%。結合感官審評，原料渥堆后清鮮感減弱，隨著微生物發酵結束而完全消失，出現明顯菌花香及陳香的香氣特征。發酵對加工中非共有揮發性組分的影響見表5。

如表5所示，111種非共有揮發性成分受濕熱環境及微生物分泌胞外酶的影響，發生復雜的變化。原料中含量較高的正己酸（汗臭味）、橙花基丙酮（清甜花香）、（E，E）-3，5-辛二烯-2-酮、正己醛、反式-2-己烯醛（清香和果香）在烘房微生物發酵過程中均未被檢測出。其他相對含量較少且具有明確清香和花果香的物質[反式橙花叔醇（青香、花香）、辛醛（果香）、香橙醛（檸檬氣味）、己酸己酯（青香，蠟香及果香）、（Z）-己酸-3-己烯酯（清香，果香）、丁位辛內酯（椰子香）、2-十一烯醛（柑橘香）、順式-3-己烯醇苯甲酸酯（清氣）、茉莉內酯（茉莉花香）、癸酸（不愉悅氣味）、苯甲酸正己酯（木香河香脂香）、（-）-石竹烯氧化物（木香）、順-3-己烯酸順-3-己烯酯（青草氣）]同樣未在S3及S4樣品中鑒定出。說明微生物發酵期間主要呈清香、青香和花果香的揮發性組分含量會大量降低。

表5 發酵對加工中非共有揮發性組分的影響Table 5 Effect of fermentation on uncommon-owned volatile components during process

續表5 發酵對加工中非共有揮發性組分的影響Continue table 5 Effect of fermentation on uncommon-owned volatile components during process

茯磚茶中代謝產物的轉化主要是由生產過程中微生物分泌的微生物酶催化的[28]。因此推測壽眉在烘房進行微生物發酵時揮發性成分的相對含量和組成比例將會受微生物酶的影響而發生復雜變化。不同發酵階段可能會對香氣組分產生不同的積累或消耗作用。111種揮發性成分中37種揮發性物質僅在S3～S4期間被檢測出。具有木香和樟腦香香氣特征的反式芳樟醇氧化物（呋喃型）在S3及S4期間相對含量明顯高于其他階段，分別為10.88%和10.70%；具有木香香氣的α-柏木烯在S3和S4階段相對含量分別為0.07%和0.06%。此外，反-3-己烯醇、二氫2，2，6-三甲基-6-乙烯基-2H-吡喃-3（4H）-酮、順-3-己烯-1-醇和2，4，4-三甲基-2-戊烯醛等物質在微生物發酵結束后相對含量較高，分別為1.58%、1.22%、4.4%和0.82%。這些變化對于改善壽眉粗老氣及青氣重的香氣品質具有重要作用，同樣對豐富白茶香型具有重要意義。

3 討論與結論

本研究測定了壽眉在微生物發酵過程中的34種主要滋味物質（組分）和142種揮發性物質，同時對不同加工階段樣品進行了感官品質鑒定。感官審評結果表明，壽眉經渥堆發酵后滋味向醇厚帶菌香轉變，香氣由清鮮帶青氣變為菌花香帶陳香或藥香，湯色由黃亮轉化為橙紅明亮，干茶及葉底色澤明顯加深。主要滋味物質發生不同程度的變化，茶多酚、兒茶素、游離氨基酸和茶黃素含量顯著降低；沒食子酸含量顯著增加；可溶性糖、水浸出物、黃酮及咖啡堿含量變化差異性不顯著。故推測金花白茶的口感特征主要是在微生物發酵過程中形成的，在此過程中促使茶葉產生澀味、苦味和酸味的物質大大減少，改善了壽眉的滋味及湯色品質。

壽眉香氣品質的改變是基于原料本身、渥堆發酵及烘房發酵期間冠突散囊菌大量繁殖促使茶葉代謝物發生系列變化所致。本次試驗所鑒定出的142種揮發性成分中，醇類及雜環類物質始終保持較高含量，具有明確香氣類型特征物質整體增加量高于減少量。其中31種成分為整個加工階段所共有的物質。111種非共有成分中18種主要呈清香、青香或花果香的揮發性組分發生大量轉化，僅在S1和S2期間被鑒定出，37種以花（木）香、陳香或藥香為主的組分僅在S3和S4期間被鑒定出。總體來看，N-乙基琥珀酰亞胺、芳樟醇氧化物（呋喃型）、反式芳樟醇氧化物（呋喃型）、水楊酸甲酯、柏木腦、α-柏木烯、苯甲醇、β-環檸檬醛、苯乙醛、橙花醇、癸醛、甲基庚烯酮、苯甲醛及γ-壬內酯對于壽眉微生物發酵后菌花香和陳香品質的出現至關重要。

白茶微生物發酵過程中許多反應會同時發生。本次試驗僅測定了部分常見化合物的動態變化，代謝產物的變化與微生物之間的關系尚未得到研究，黃酮類物質總量在干燥期間明顯上升的原因仍不清晰。今后應結合代謝組學、微生物組學進一步深入發掘白茶微生物發酵過程中風味物質的變化機理，為金花白茶產業化發展提供更多可靠的數據支持。