紅小米黃酒發酵過程中風味物質與細菌菌群分析

王春艷，于海彥，喬志航，許彬，羅建成

（南陽理工學院 河南省工業微生物資源與發酵技術重點實驗室，河南 南陽 473004）

黃酒是世界三大發酵酒之一，擁有悠久的歷史文化，因其獨特的口感風味、低酒精含量、豐富的營養，深受人們的喜愛[1-2]。黃酒的品質主要取決于釀造風味，酒體中的醇、醛、酯、酚等揮發性物質相互作用、交匯融合使其具有一系列香氣特征，賦予黃酒獨特的口感[3]。在眾多種類的揮發性物質中，含3個碳原子以上的醇類被稱為高級醇，高級醇是黃酒中重要的風味物質，適量的高級醇給人一種醇香宜人的感受，但高級醇過量則容易引起異雜味和致醉性[4-5]。因此，對黃酒揮發性風味物質以及高級醇的檢測分析十分重要。

黃酒由多菌種混合發酵而成，屬于半開放型，在發酵過程中，微生物利用酒醪原料進行代謝生成多種風味物質，而代謝產物又會正向或反向地影響著微生物的生長和新陳代謝，進而改變黃酒發酵過程及最終黃酒的風味和口感[6-7]。黃酒釀造過程中的微生物與風味物質關系復雜，尋找與風味物質密切相關的功能性微生物研究有利于提高和控制黃酒品質。

目前，南方黃酒大多以糯米為原料，北方大多以黍米為原料[8]，也有學者以燕麥[9]、玉米[10]、苦蕎[11]等為原料釀造黃酒，促進了黃酒的多元化發展。紅小米為南陽盆地特產，因谷殼呈紅色，本地俗稱紅谷。與糯米、黍米等農作物相比，紅小米淀粉含量較低，蛋白質、脂肪和維生素含量較高，且富含人體必需的8種氨基酸，比例協調，具有較高的營養價值[12]。目前尚未有學者對南陽紅小米黃酒釀造過程中的微生物群落、揮發性風味物質及其相關性進行研究。

本文以南陽紅小米為原料，采用攤飯法進行黃酒釀造，對釀造過程中的揮發性風味物質、微生物群落進行解析，并利用統計學原理對兩者之間的相關性進行預測。本研究將揭示南陽紅小米黃酒獨特口感的微生物機制，為更好的品質控制提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

紅小米：南陽市（世界美酒特色產區）鎮平縣；紹酒風味T3釀酒曲（根霉菌、酶活20 000 U/g的α-淀粉酶、酶活100 000 U/g的葡萄糖淀粉酶、釀酒酵母）：安琪酵母股份有限公司；麥曲：山東梁山徐曙生物工程有限公司；3-辛醇（色譜純）：美國Sigma公司；DP328糞便基因組DNA提取試劑盒：天根生化科技（北京）有限公司；QIAquick膠回收試劑盒（28706）：德國QIAGEN公司。

1.2 試驗儀器與設備

立氏壓力蒸汽滅菌器（LDZX-50FB）：上海申安醫療器械廠；電熱恒溫培養箱（DNP-9082）：上海精宏試驗設備有限公司；電子分析天平（BSA224S-CW）：德國賽多利斯集團；臺式高速冷凍離心機（Centrifuge 5430R）：Eppendorf德國艾本德股份公司；氣相色譜質譜聯用儀（7890A-5975C）、HP-INNOWAX色譜柱（60m×250μm×0.5 μm）：美國安捷倫科技有限公司；T100TM梯度PCR儀：美國Bio-RAD公司；Miseq高通量測序儀：美國Illumina公司。

1.3 方法

1.3.1 紅小米黃酒釀造與取樣

采用攤飯法釀造紅小米黃酒。取0.25 kg紅小米淘洗干凈，置于潔凈的1 L燒杯內，加自來水浸泡，水面超過米層3cm左右，燒杯口用兩層無菌紗布覆蓋，早晚各換1次水，室溫（18℃～21℃）下浸泡24 h后瀝干水分，置于不銹鋼鍋內水煮直至出現糊香味，攤涼冷卻至35℃。麥曲接種量為10.0%，釀酒曲接種量為0.45%，均勻攪拌后，裝入5 L黃酒發酵罐中，依次用封口膜（扎孔）和紗布進行封罐。黃酒罐室溫（18℃～21℃）內持續發酵24 d，發酵前期對其進行攪拌，使其充分發酵。

分別取第 0（投料當天）、2、4、6、9、12、18、24 天的發酵樣品10 g，4 000 r/min離心10 min，取上清液用于測定揮發性風味物質，剩余樣品轉入無菌離心管中，-20℃保存，用于提取微生物總DNA。樣本分別命名為HJB0、HJB2、HJB4、HJB6、HJB9、HJB12、HJB18、HJB24。

1.3.2 紅小米黃酒風味物質的測定

采用頂空進樣氣相色譜-質譜聯用儀，對紅小米黃酒中揮發性風味物質進行定性確定和定量分析。取8 mL已離心的紅小米黃酒發酵液加入到20 mL頂空瓶中，再加入 1.5 g NaCl和 25 μL內標物（3-辛醇，質量濃度為300 mg/L）。采用頂空進樣器處理樣品，樣品處理溫度60℃，定量環/閥溫度100℃，傳輸線溫度110℃，樣品處理時間45 min，壓力平衡時間0.25 min，進樣時間1 min。

氣相色譜-質譜法（gas chromatography-mass spec trometry，GC-MS）條件：進樣口溫度240℃；升溫程序為50℃保持2 min，以3℃/min升溫至80℃，再以5℃/min升溫至230℃，保持10min；載氣流速1mL/min；電離方式電子電離（electron ionization，EI）；電子能量70 eV；離子源溫度230℃；傳輸線溫度250℃；質量掃描范圍m/z為29～350，通過美國國家標準與技術研究院（National Institute of Standards and Technology，NIST）譜庫對比風味物質。

揮發性風味物質的半定量分析，將GC-MS檢測的高級醇和內標物（3-辛醇）的吸收峰面積代入下面公式，計算紅小米黃酒中揮發性風味物質的含量。

式中：Cx為紅小米黃酒中某種風味物質的濃度，μg/L；Cs為內標物的濃度，μg/L；Ax為紅小米黃酒中待測風味物質的峰面積；As為內標物的峰面積。

1.3.3 紅小米黃酒微生物群落結構測定

使用（DP328）糞便基因組DNA提取試劑盒提取黃酒發酵物微生物總DNA。擴增16S V3-V4區，采用的引物為 B341F（5′-CCTACGGGNGGCWGCAG-3′）和B785R（5′-GACTACHVGGGTATCTAATCC-3′）。聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）擴增程序為95℃預變性3 min；95℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸30 s，共計25個循環；最后72℃延伸5 min。PCR產物切膠純化后進行精準定量，送第三方公司進行Illumina MiSeq高通量測序。

為得到高質量的測序數據，以提高后續生物信息分析準確性，使用Vsearch以及Cutadapt軟件對原始下機數據進行拼接、質控和過濾，得到有效數據。97%相似性水平下對非重復序列（不含單序列）進行操作分類單元（operational taxonomic unit，OTU）聚類分析，同時采用Denovo模塊去除嵌合體序列。選取OTU代表序列與Silva數據庫進行比對，使用Mothur軟件找出與OTU序列相似度最高且可信度達80%以上的物種信息用于OTU注釋，從而完成不同水平下的每個樣品的群落結構分析。

1.3.4 紅小米黃酒揮發性風味物質與微生物相關性分析

利用RStudio中的psych軟件包計算微生物與揮發性風味物質之間的Spearman相關系數（r），以r＞0.5且p＜0.05為閾值找出可視化對象，選用Gephi 0.92對微生物和代謝物之間的相關性進行可視化，以表征微生物對揮發性風味物質的貢獻[13]。

2 結果與分析

2.1 揮發性物質在紅小米黃酒發酵過程中的動態變化

紅小米黃酒風味物質的測定結果見圖1。

圖1 紅小米黃酒發酵過程中揮發性物質變化Fig.1 Changes in volatile compounds during red millet rice wine fermentation

通過GC-MS對紅小米黃酒發酵過程中的揮發性風味物質進行鑒定，共得到70種揮發性物質成分，包括高級醇類15種、酯類24種、烷類10種、醛酮類17種、其他類（如環辛四烯）4種，酯類與高級醇類占揮發性風味物質總含量的90%以上。由圖1可知，投料當天（0 d），揮發性組分處于較低水平；0～2d高級醇類迅速增加，酯類與醛酮類化合物也隨之上升，發酵第18天，酯類物質含量超過高級醇類成為含量最高的物質，發酵第24天，揮發性風味物質含量達到峰值，為44 362.59 μg/L。

黃酒發酵過程中，酯類物質含量為161 μg/L～24 736 μg/L，其中乙酸乙酯、乙酸異戊酯、丙酸乙酯、己酸乙酯、辛酸乙酯、葵酸乙酯是主要的酯類化合物。與其它已研究的麥曲黃酒[14]、清爽型黃酒[15]、紹興機械化黃酒[16]的揮發性物質相比，紅小米黃酒揮發性物質種類較多，但酯類相對較少，高級醇類、醛酮類較多。

2.2 高級醇在紅小米黃酒發酵過程中的動態變化

高級醇在紅小米黃酒發酵周期中的種類及含量見表1。

表1 高級醇在紅小米黃酒發酵過程中的變化Table 1 Changes of higher alcohols during fermentation of red millet rice wine μg/L

續表1 高級醇在紅小米黃酒發酵過程中的變化Continue table 1 Changes of higher alcohols during fermentation of red millet rice wine μg/L

由表1可知，整個發酵過程中共檢測出包括異丁醇在內的15種高級醇。投料當天（0 d）檢測出4種高級醇，其含量處于較低水平，0～2 d時，高級醇含量迅速升高，隨后緩慢增長，第18天達到最大值，為13 828.9 μg/L。

投料當天（0 d），檢測出4種高級醇，分別為異丁醇、異戊醇、正己醇和糠醇。在整個發酵過程中，穩定存在的高級醇（檢出次數＞4）包括β-苯乙醇、正丙醇、正丁醇、異丁醇、異戊醇、正戊醇、糠醇和2，3-丁二醇，其中正戊醇含量較低（2.28 μg/L～4.06 μg/L），正丁醇、異丁醇、異戊醇、糠醇和2，3-丁二醇含量隨發酵時間的延長逐漸上升并趨于穩定。所有時間段均檢測出的高級醇為異丁醇和異戊醇，其含量分別占高級醇總含量的12.58%～18.26%和72.89%～80.29%，是本次黃酒發酵檢測到的豐度最高的兩種揮發性物質。檢出次數≤4的高級醇包括仲丁醇、正己醇、正庚醇、3-甲基-1-戊醇、六甘醇、3-甲硫基丙醇和丙烯醇。僅在發酵前期（0～6 d）檢測到正己醇，發酵后期（9 d～24 d）高級醇種類顯著增加，如仲丁醇、丙烯醇、正庚醇等均有檢出。

將已有研究的不同類型的黃酒在其發酵過程中的高級醇種類、主要高級醇平均含量（去除投料當天）進行對比分析，分析結果見表2。

表2 不同類型黃酒發酵過程中的高級醇對比分析Table 2 Comparison of higher alcohols during fermentation of different types of rice wine

由表2可知，所研究的幾種類型的黃酒主要檢測到的高級醇為異丁醇、異戊醇、β-苯乙醇3種，清爽型黃酒和紹興機械化黃酒主要高級醇的平均含量是其他類型黃酒的10倍～100倍，紅小米黃酒的高級醇種類居中，β-苯乙醇含量很低，異丁醇、異戊醇的平均含量高于麥曲黃酒和燕麥黃酒。由此可見，不同釀造工藝，不同風味的黃酒高級醇含量差別明顯。

2.3 高通量測序結果及Alpha多樣性分析

利用Illumina Miseq測序平臺得到樣品HJB0、HJB2、HJB4、HJB6、HJB9、HJB12、HJB18、HJB24 的原始測序數據分別為 21 522、22 141、28 199、26 455、20 729、22 153、23 897、20 961條，經過質控得到有效數據，并對其Alpha多樣性進行分析，結果見表3。

表3 紅小米黃酒樣品細菌群落豐度和多樣性參數Table 3 Bacterial community richness and diversity indices of red millet rice wine samples

由表3可知，8個樣品的覆蓋率均＞99.0%，表明試驗測序深度合理，測序結果可以反映真實的樣本情況。4個指數中，香農指數越大，群落物種的多樣性越高，辛普森指數越大，說明群落多樣性越低，而豐富度指數或ACE指數越大，則表明群落物種豐富度越高。樣本HJB4的香農指數（1.63）最高，辛普森指數（0.33）最低，豐富度指數及ACE指數均較高，表明紅小米黃酒發酵至第4天細菌微生物群落多樣性達到峰值，隨著發酵的進行，微生物多樣性和豐富度下降較為明顯，發酵末期又有所回升。

根據高通量測序結果所獲取的信息，在門水平上進行細菌微生物群落分析，共得到5個門，其中優勢菌門有2個，分別為厚壁菌門（Firmicutes）和變形菌門（Proteobacteria），這與多數黃酒釀造微生物的相關研究相一致[14-18]。門水平紅小米黃酒微生物群落結構分析結果見圖2，屬水平紅小米黃酒微生物群落結構分析結果見圖3。

圖2 門水平紅小米黃酒微生物群落結構分析Fig.2 Analysis of bacterial community structure in red millet rice wine based on phyla levels

圖3 屬水平紅小米黃酒微生物群落結構分析Fig.3 Analysis of bacterial community structure in red millet rice wine based on genus levels

由圖2可知，變形菌門在發酵前4 d占據優勢，相對豐度為94.49%～57.54%。隨著發酵的進行，厚壁菌門逐漸成為優勢菌門，發酵第9天至結束，厚壁菌門的相對豐度均超過98%。

由圖3可知，對OTU注釋，共得到了55個屬，其中相對豐度＞1%的優勢菌屬共有7種，分別是腸球菌屬（Enterococcus）、克魯沃菌屬（Kluyvera）、乳酸桿菌屬（Lacticaseibacillus）、大洋芽孢桿菌屬（Oceanobacillus）、魏斯氏菌屬（Weissella）、克羅彭斯特菌屬（Kroppenstedtia）和Lentilactobacillus，非優勢菌屬及未分類的OTU歸為其它。

本研究的紅小米黃酒發酵過程中Lacticaseibacillus是相對豐度最高的細菌，由圖3可知，從第2天的6.61%迅速增加，第9天達到最高值95.79%，隨后緩慢降低，最終豐度值為48.6%。黃酒發酵前后期呈現出顯著不同的細菌群落結構，發酵前期（2 d～6 d）菌群豐富，優勢菌 Oceanobacillus、Weissella、Kluyvera、Enterococcus和Kroppenstedtia均出現豐度最高值；發酵后期（9 d～24 d）上述5種細菌基本無檢出，Lentilactobacillus增長明顯，最終豐度為41.88%，成為絕對優勢菌。分析原因可能是由于黃酒發酵后期呈現的高酒精、高酸、缺氧的環境抑制了某些微生物的生長，給耐受細菌提供了更多的生態位[19-20]。

2.4 紅小米黃酒核心微生物與揮發性物質的相關性

選取豐度前20的細菌屬和70種揮發性風味物質作相關性分析，計算他們之間spearman相關系數（r），選取r>0.5且p<0.05作為有效的網絡連接并繪圖，結果見圖4。

圖4 揮發性物質與主要微生物的相關性網絡分析Fig.4 Correlation network between volatile compounds and microbial genera

如圖4所示，共有45個有效節點，81項關聯。其中 ，Bacillus、Lentilactobacillus、Companilactobacillus 是連接最大的 3個屬（21、18、18），相關化合物主要是對黃酒風味的產生具有重要作用的醇類和酯類。Lacticaseibacillus與甲基環戊烷（B3）以及4種醇類、4種醛酮類有關聯。正己醇（V8）與 Kluyvera、Kroppenstedtia、Enterococcus、Oceanobacillus、Weissella、Lentibacillus 均具有相關性。三氯甲烷（B4）和十七烷（B7）與O－ceanobacillus產生了相關性，乙酸乙酯（A2）只與Bacillus相關，庚酸乙酯（A11）只與Lentibacillus相關。以上結果表明，在本次紅小米黃酒發酵過程中，對風味物質的主要貢獻細菌群為 Bacillus、Lentilactobacillus、Companilactobacillus和Lacticaseibacillus。紅小米黃酒發酵過程中與風味物質形成有關的細菌主要集中在芽孢桿菌屬與乳桿菌屬，并未見其他報道中的糖多孢菌屬和泛菌屬[21-22]，推測主要是與發酵原料的不同有關。

3 結論

本研究以南陽特色紅小米為主要原料進行黃酒釀造，從微生物組和代謝組的角度，結合多元統計學分析揭示黃酒發酵過程中微生物與揮發性風味物質的相關性。本次黃酒發酵試驗共檢測到70種揮發性風味物質，酯類與高級醇含量占總含量的90%以上，其中高級醇15種，異戊醇、異丁醇豐度較高。高通量測序結果揭示黃酒發酵至第4天，細菌群落結構多樣性達到最高。門水平上，豐度最高的是厚壁菌門（Firmicutes）和變形菌門（Proteobacteria）；屬水平上，優勢屬共有7個。相關性研究發現，對風味物質的主要貢獻細菌群為 Bacillus、Lentilactobacillus、Companilactobacillus和Lacticaseibacillus。本研究結果可以為實現合成微生物組生產黃酒及其品質的定向調控奠定理論基礎。