咖啡酸與牛血紅蛋白的相互作用及抗氧化研究

周向軍，鄒亞麗，孫文媛，高義霞

（天水師范學院 生物工程與技術學院，甘肅 天水 741001）

咖啡酸（caffeic acid，CA）又稱3，4-二羥基肉桂酸，是一種天然酚酸類化合物，廣泛存在于中藥材[1]、咖啡、蔬菜、水果等食物中，具有抗病毒[2]、抗癌[3]、抗氧化[4]、抗菌[5]、保護心血管[6]和紅細胞[7]以及降血糖[8]等功效。血紅蛋白是脊椎動物體內運輸O2和小分子活性化合物的別構蛋白，由珠蛋白和血紅素組成，具有維持血液酸堿平衡和作為天然食品添加劑[9]等功能。牛血紅蛋白（bovine hemoglobin，BHb）與人血紅蛋白一級結構同源性高達90%，空間結構高度一致且BHb容易獲得，因而常作為模型蛋白。當CA進入體內后通過血液運輸至靶器官的過程中，會對BHb的空間構象和生物學功能產生一定影響。目前相關研究主要以牛血清白蛋白為主[10-11]，且由于CA的水溶解性較差[12-13]，在行業應用中常需添加不同濃度的乙醇、二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）等助溶劑。因此，本試驗通過紫外光譜、熒光光譜、同步熒光光譜、紅外光譜及對DPPH自由基和ABTS+自由基能力的測定，研究CA和BHb在3種不同溶劑體系中的相互作用和抗氧化性，為明確CA在體內運輸及對BHb空間構象的影響等提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

牛血紅蛋白（分析純）：美國Worthingtong Biochemical Corporation；ABTS試劑（色譜純）：索萊寶生物科技有限公司；咖啡酸、DMSO、乙醇（均為分析純）：生工生物工程（上海）股份有限公司；DPPH（分析純）：日本東京化成工業株式會社。

1.2 儀器與設備

RF5301熒光光譜儀、UV-1800紫外可見分光光度計：島津（中國）有限公司；Nicolet iS5紅外光譜儀：美國賽默飛世爾科技公司；PHS-3D型pH計：上海儀電科學儀器股份有限公司；ME204電子天平：梅特勒托利多科技（中國）有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 紫外光譜測定

用dH2O將BHb配制成1.5×10-3mol/L儲備液，用DMSO將CA配制成1.5×10-3mol/L儲備液。反應體系中固定BHb濃度為1.0×10-5mol/L，分別用dH2O、10% DMSO和10%乙醇稀釋，使CA終濃度分別為0、3×10-5、6×10-5、9×10-5、12×10-5mol/L。在 250 nm～500 nm 掃描紫外光譜[14]。

1.3.2 熒光光譜和同步熒光光譜測定

反應體系中固定BHb濃度為1.0×10-5mol/L，分別用dH2O、10% DMSO和10%乙醇稀釋，使CA終濃度分別為 0、3×10-5、6×10-5、9×10-5、12×10-5mol/L。上述體系在 298、304、310 K，激發波長 280 nm，300 nm～500 nm進行熒光光譜掃描[15]。固定Δλ=15 nm、Δλ=60 nm掃描同步熒光光譜[16]。

1.3.3 紅外光譜測定

固定CA終濃度為1.5×10-4mol/L，BHb終濃度為1.5×10-4mol/L。在 4 000 cm-1～400 cm-1范圍內，分辨率為4 cm-1下掃描紅外光譜[17]。

1.3.4 抗氧化性測定

DPPH自由基清除率參考封易成等[18]的方法，CA和BHb終濃度分別為1.5×10-2mol/L和1.5×10-5mol/L。ABTS+自由基清除率參考Peng等[19]的方法，CA和BHb終濃度分別為1.5×10-2mol/L和1.5×10-3mol/L。固定CA濃度為1.5×10-2mol/L，添加BHb使其終濃度分別為0、0.1×10-5、0.2×10-5、0.4×10-5、0.8×10-5、1.6×10-5mol/L，分析CA對DPPH自由基清除率的影響；固定CA濃度為1.5×10-2mol/L，添加BHb使其終濃度分別為0、0.1×10-3、0.2×10-3、0.4×10-3、0.8×10-3、1.6×10-3mol/L，分析CA對ABTS+自由基清除率的影響。

1.4 熒光猝滅類型、結合常數和結合位點數

CA對BHb的猝滅遵循Stern-Volmer方程[20]。

式中：F0和F分別為CA與BHb作用前后的熒光強度；Q為CA濃度，mol/L；τ0為CA不存在時BHb的壽命，10-8s；Kq為猝滅常數，L/mol；Ksv為 Stern-Volmer常數，L/（mol·s）。

假設BHb有n個結合位點可與CA相互作用，則在靜態猝滅中藥物對BSA的猝滅變化遵循公式如下。

式中：Ka為結合常數，mol/L；Q 為 CA 濃度，mol/L；n為結合位點數。

1.5 CA與BHb的結合距離

BHb熒光光譜與CA紫外光譜有一定重疊，依據Forster非輻射能量轉移理論，可求出CA與BHb中Trp殘基的結合距離。能量轉移效率與結合距離的關系計算公式如下。

式中：R0為能量轉移效率E達50%時的距離；r0為CA與BHb的距離；F0和F分別為未加CA時的熒光強度和CA與BHb摩爾比為1∶1時的熒光強度；K2為取向因子，2/3；N為介質折射指數，1.336；φ為BHb的量子產率，0.062；J為CA紫外吸收光譜和BHb熒光發射光譜的重疊積分面積，cm3·L/mol；F（λ）為 BHb 在波長λ處的熒光強度；ε（λ）為CA在波長λ處摩爾消光系數，L/（mol·cm）。

1.6 熱力學和相互作用力

當溫度變化較小時，ΔH視為常數，CA與BHb相互作用滿足Van't Hoff方程。

式中：△S 為熵變，J/mol·K；△H 為焓變，kJ/mol；△G為自由能變化，kJ/mol；R為摩爾氣體常數，8.314 5 J/（mol·K）；T為熱力學溫度；Ka為相應溫度下的結合常數，L/mol。

1.7 數據分析

采用SPSS16.0進行最小顯著性差異法統計分析，P<0.05為顯著差異。利用Origin7.5作圖。

2 結果與分析

2.1 紫外光譜

在3種不同溶劑體系中，CA-BHb紫外光譜圖見圖1。

圖1 CA-BHb紫外光譜Fig.1 Ultraviolet spectrum of CA-BHb

由圖1可知，當CA濃度小于6×10-5mol/L時，在280 nm和405 nm附近可觀察到2個吸收峰，280 nm吸收峰代表芳香族氨基酸的吸收，405 nm強吸收峰是血紅素卟啉環π-π*躍遷所形成的Soret帶。Soret帶幾乎未發生位移，僅強度略有不規律變化，這表明CA對BHb的血紅素輔基幾乎不產生影響[21]。3種溶劑體系幾乎均在350 nm附近形成等吸收點，這表明CA與BHb可形成具有確定計量比的配合物，游離BHb與CA-BHb達到平衡。當CA濃度大于6×10-5mol/L時，在312 nm附近開始出現新吸收峰，這表明較高濃度的CA可對BHb的空間構象產生影響[22]。

隨著CA濃度的增加，一方面BHb在280 nm吸收增強，原因是CA使BHb分子中Tyr、Trp等生色基團暴露以及CA的紫外吸收，另一方面BHb發生紅移，原因是CA使BHb分子π-π*躍遷所需能量減少[23]。另外，由于靜態猝滅會改變BHb吸收強度，而動態猝滅則不影響BHb吸收強度[24]，據此可初步認為CA對BHb的熒光猝滅為靜態猝滅。

2.2 熒光光譜

CA-BHb的熒光光譜圖見圖2。

圖2 CA-BHb熒光光譜Fig.2 Fluorescence spectrum of CA-BHb

由圖2可知，當激發波長為280 nm時，Phe熒光信號通常較弱且以共振能形式將能量轉移至Trp殘基上，理論上Tyr熒光峰應在304 nm附近，但3種溶劑體系均未在304 nm附近出現熒光峰，這表明BHb分子發生了從Tyr殘基到Trp殘基的能量轉移。在3種溶劑體系中，隨著CA濃度的增加，BHb在330 nm處熒光強度呈規律性下降，且熒光峰逐漸從330 nm紅移至340 nm附近，這表明CA與BHb的相互作用可使BHb二級結構發生改變，Trp殘基所處微環境的親水性增加[25]。另外，在3種不同溶劑體系中，BHb在410、410、385 nm附近形成等發射點，再次表明CA對BHb的作用可能為靜態猝滅[26]。

2.3 熒光猝滅類型、結合常數和結合位點數

不同溫度和溶劑條件下的計算結果見表1。

由表1可知，在3種不同溶劑體系中，Kq隨溫度升高而降低且均大于最大動態擴散猝滅常數2.0×1010L/（mol·s），因此CA對BHb的猝滅類型以靜態猝滅為主[27]。經過計算得出，在dH2O、10% DMSO和10%乙醇溶劑中，平均結合位點數（n）分別為1.44、1.28和1.27，說明CA與BHb約有1個結合位點。一般認為，結合常數數量級在104～106范圍內時相互作用力較強，3種不同溶劑體系中Ka為107數量級，這表明CA與BHb相互作用較強，CA在體內可被BHb轉運。

表1 不同溶劑中CA-BHb的猝滅常數、結合常數和結合位點數Table 1 Ksv，Kaand n of CA-BHb in different solvents

2.4 CA與BHb的結合距離

由計算可得，在3種溶劑體系中，CA與BHb的距離r0分別為1.748、1.697 nm和1.781 nm，均小于7 nm，表明BHA與CA間發生非輻射能量轉移使BHb熒光猝滅，且猝滅方式為靜態猝滅。

2.5 熱力學和相互作用力

熱力學參數計算結果見表2。

表2 不同溶劑體系中CA-BHb的熱力學參數Table 2 Thermodynamic parameters in different solvents

續表2 不同溶劑體系中CA-BHb的熱力學參數Continue table 2 Thermodynamic parameters in different solvents

根據Ross理論，CA和BHb之間的作用力主要有疏水作用力（△H＞0，△S＞0）、氫鍵或范德華力（△H＜0，△S＜0）及靜電引力。由表2可知，CA與BHb在3種不同的溶劑中，相互作用能夠自發進行且作用力為疏水作用力。

2.6 同步熒光光譜

BHb分子中Trp、Tyr和Phe殘基的熒光峰在一定條件下可發生重疊現象，選擇合適的波長差可將重疊熒光峰分開。△λ=15 nm和△λ=60 nm分別代表Tyr和Trp殘基的熒光光譜[30]。3種不同溶劑體系中△λ=15 nm和△λ=60 nm的同步熒光光譜見圖3～圖5。

圖3 dH2O中CA-BHb同步熒光光譜Fig.3 Synchronous fluorescence spectrum of CA-BHb in dH2O

圖4 10%乙醇中CA-BHb同步熒光光譜Fig.4 Synchronous fluorescence spectrum of CA-BHb in 10% ethanol

圖5 10% DMSO中CA-BHb同步熒光光譜Fig.5 Synchronous fluorescence spectrum of CA-BHb in 10% DMSO

280 nm處的熒光峰歸屬于BHb四聚體中的Trp殘基，325 nm處的熒光峰歸屬于BHb二聚體中的Trp殘基[31-32]。由圖 3（a）、圖 4（a）和圖 5（a）可知，隨著 CA濃度的增加，Tyr殘基的熒光強度逐漸降低且輕微紅移，這表明Tyr殘基所處微環境的親水性略有增強；由圖 3（b）、圖 4（b）和圖 5（b）可知，隨 CA 濃度增加，Trp殘基的熒光強度逐漸降低且熒光猝滅程度大于Tyr。這表明CA與Trp殘基的相互作用強于Tyr殘基，其結合位點更接近于Trp殘基而非Tyr殘基。

2.7 紅外光譜

CA-BHb紅外光譜見圖6。

圖6 CA對BHb紅外光譜的影響Fig.6 The effects of CA on infrared spectrum of BHb

1600 cm-1～1700 cm-1為酰胺I帶特征區，主要歸屬為C=O的伸縮振動，1 500 cm-1～1 600 cm-1為酰胺II帶特征區，主要歸屬為C-N的伸縮振動和N-H面內變形振動[33]。在3種不同溶劑體系中，CA均增強BHb的紅外吸收，這是由于CA酚羥基與BHb分子中C=O或C-N形成氫鍵，引起BHb多肽鏈上氫鍵的重排，最終導致其二級結構發生變化[34]。

1640cm-1～1610cm-1為 β-折疊，1650cm-1～1640cm-1為無規則卷曲，1 660 cm-1～1 650 cm-1為 α-螺旋[35]。由圖6（a）可知，在dH2O溶劑體系中，CA可使BHb的酰胺I帶從1 659.446 cm-1微弱紅移至1 656.071 cm-1，這表明BHb以 α-螺旋為主[36]。由圖6（b）可知，在 10%乙醇溶劑體系中，CA可使BHb的酰胺I帶在1 628.108 cm-1附近出現肩峰，這表明部分BHb已由α螺旋轉化為β折疊。由圖6（c）可知，在10% DMSO溶劑體系，CA可使BHb的酰胺I帶從1657.035cm-1紅移至1627.144cm-1，表明BHb已大部分由α螺旋轉化為β折疊。圖6（c）中原1 657.035 cm-1處的紅外吸收峰幾乎完全消失，原因是DMSO中的S=O具有較強的氫鍵形成活性，會競爭性破壞BHb分子中維持α-螺旋穩定的氫鍵，從而使α-螺旋特征性吸收峰消失[37]。由于α-螺旋反映的是BHb分子的致密性，β-折疊等反映了BHb分子的松散性，故與dH2O體系相比較，10%乙醇和10% DMSO兩種體系使BHb空間結構更加伸展。

由圖6（a）可知，酰胺II帶位置未發生位移，由圖6（b）和圖 6（c）可知，酰胺 II帶分別從 1 543.738 cm-1紅移至 1 526.864 cm-1，從 1 536.506 cm-1紅移至1 517.221 cm-1，BHb空間結構的有序性有所降低[38]。分析認為，有機溶劑的介電常數較低，因而增強了分子間的靜電引力，而CA與BHb分子間的氫鍵作用，從本質上講也是一種靜電引力。上述結果表明，在3種不同溶劑體系下，CA與BHb的相互作用對BHb的二級結構影響不同，即低極性溶劑體系易使BHb分子的酰胺I帶和酰胺II帶發生紅移，甚至完全消失。

2.8 CA對DPPH自由基和ABTS+自由基的抗氧化性

CA對DPPH自由基和ABTS+自由基的清除率見圖7。

圖7 不同溶劑體系下CA對DPPH和ABTS+自由基的清除作用Fig.7 DPPH and ABTS+scavenging activity of CA in different solvents

由圖7可知，當加入BHb后，CA對DPPH自由基清除率均顯著降低（P<0.05），對ABTS+自由基清除率無顯著影響（P>0.05），這表明BHb對CA抗氧化性的影響與所采用的抗氧化體系有關[39]。由于CA抗氧化性取決于其分子中的酚羥基，故可初步認為DPPH自由基促進BHb與CA分子間氫鍵的形成，從而降低CA抗氧化性，而ABTS+自由基則不影響BHb與CA分子間氫鍵的形成，因而對CA抗氧化性影響不明顯。

為進一步了解CA對DPPH和ABTS+自由基的清除作用是否對BHb濃度具有依賴性，以dH2O為代表，分別在 0～1.6×10-5mol/L、0～1.6×10-3mol/L 范圍內分析BHb對CA清除DPPH和ABTS+自由基的影響，結果見圖8。

圖8 dH2O體系中BHb對CA清除DPPH自由基和ABTS+自由基的影響Fig.8 DPPH radical and ABTS+radical scavenging activity of CA with different BHb concentration in dH2O

由圖 8（a）可知，在 0.1×10-5mol/L～1.6×10-5mol/L內，隨著BHb濃度的增加，CA對DPPH自由基清除率呈顯著下降趨勢（P<0.05），具有一定的濃度依賴性。由圖 8（b）可知，在 0.1×10-3mol/L～0.4×10-3mol/L 內，CA對ABTS+自由基清除率呈顯著增加趨勢（P<0.05），在0.4×10-3mol/L～1.6×10-3mol/L 范圍內，CA 對 ABTS+自由基清除率呈顯著降低趨勢（P<0.05），但并未呈現濃度依賴性。

3 結論

本文運用紫外光譜、熒光光譜、同步熒光光譜和紅外光譜及對DPPH自由基和ABTS+自由基的清除率等方法，研究在dH2O、10%乙醇、10% DMSO溶劑體系中，CA和BHb的相互作用及其對CA抗氧化性的影響。在3種不同溶劑體系中，CA均可靜態猝滅BHb內源熒光，使BHb分子Trp殘基微環境的親水性增強。CA與BHb的結合是自發的且以疏水作用力為主，約有1個結合位點且更接近Trp而非Tyr殘基。在10%乙醇和10% DMSO體系中，BHb酰胺I帶和酰胺II帶發生明顯紅移，二級結構由α-螺旋逐漸向β-折疊轉變。在3種不同溶劑體系中，CA-BHb顯著降低了CA對DPPH自由基清除率，但對ABTS+自由基清除率無明顯影響。該研究有助于從分子水平了解CA在體內的轉運、代謝及對BHb空間構象和生物學功能的影響，為設計有效CA載體提供依據。