超聲波輔助纖維素酶提取黃瓜皮色素工藝研究

高一帆，李若思，吉莉，孫紅艷*

（1.太原科技大學 化學與生物工程學院，山西 太原 030024；2.太原科技大學 環(huán)境科學與工程學院，山西 太原 030024）

石油化工合成色素已廣泛應用于各種食品中，但其會對人體健康產(chǎn)生不利影響，因此科學界必須探索更安全、自然和生態(tài)友好的色素。水果、蔬菜的果皮、種子、果渣等副產(chǎn)品中含有豐富的花青素、類胡蘿卜素、葉綠素等天然色素[1-3]，其安全且具有潛在價值，在食品工業(yè)中被廣泛應用[4-5]。為了滿足日漸增長的社會需求，如何高效、便捷、充分提取天然色素，已成為色素生產(chǎn)的關鍵問題[6-10]。

索氏提取技術、浸漬或氫蒸餾等[11]傳統(tǒng)提取天然色素的方法提取率較低、過程復雜、耗時長且成本高。因此，需要創(chuàng)新技術。研究報道，超聲波輔助纖維素酶技術因其對溶劑要求極低、快速、方便、可提高提取率、保護色素不被降解等優(yōu)點而受到人們的青睞，此外，乙醇被認為是很好的綠色提取溶劑，其對人類健康無影響且不會造成環(huán)境污染，受到大眾喜愛[12-15]。

黃瓜是葫蘆科的一種暖季型蔬菜[16]，其清香爽口、耐儲存，是人們食用較多的一類菜肴[17]。其中，黃瓜果皮含有大量的天然色素（類胡蘿卜素及葉綠素）。然而，現(xiàn)有研究對黃瓜農(nóng)副食品廢棄物的價值化探索甚少，黃瓜果皮并不為人類所消耗，每天產(chǎn)生的大量黃瓜皮被當作垃圾處理，會造成污染源[17-18]，對其進行資源利用很有必要。

此外，尚未有利用超聲波輔助纖維素酶提取黃瓜果皮中色素的研究。因此，本研究以黃瓜皮為原料，通過超聲波輔助酶解提取黃瓜皮中的色素，采用單因素試驗和正交試驗優(yōu)化提取條件，確定最佳的提取工藝并測定該條件下提取的色素含量，以期為黃瓜皮的進一步加工利用提供一定技術支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

黃瓜：市售。95%乙醇（分析純）：國藥集團化學試劑有限公司；纖維素酶（10萬U/g）：上海源葉生物科技有限公司。

1.2 儀器與設備

電子分析天平（ME54T）：梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；電熱鼓風干燥箱（GZX-9030MBE）：上海博迅實業(yè)有限公司；高速萬能粉碎機（FW80）：北京市永光明醫(yī)療儀器廠；紫外分光光度計（UV-2600i）：島津儀器（蘇州）有限公司；高速臺式離心機（5430R）：艾本德（上海）國際貿(mào)易有限公司；超聲波恒溫水浴（SCQHD300A）：上海聲彥超聲波儀器有限公司；恒溫搖床（BILON-COS-100B）：上海比朗儀器制造有限公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品制備

挑選成熟度好且無損傷的新鮮黃瓜，充分清洗干凈，并使其皮肉分離，在剔取黃瓜皮時應注意盡量減少黃瓜果肉的連帶量，以減少測量誤差；盡可能將得到的果皮切成小塊（1 cm×1 cm）；然后將切好的黃瓜皮置于50℃的電熱鼓風干燥箱中進行烘干，粉碎過篩（60目），得到黃瓜皮粉，并放入4℃冰箱保存。

1.3.2 提取色素方法

將制備好的黃瓜皮粉置于10 mL具塞玻璃試管中，加入9 mL 95%乙醇。懸浮液用超聲波恒溫水浴（超聲溫度30℃、超聲功率250 W）提取，然后將纖維素酶溶解于其中，將獲得的混合液在恒溫培養(yǎng)搖床（溫度50℃、120 r/min）中孵育20 min，再將該混合液離心（8 500 r/min、10 min），分層后取上清液，并將其放在4 ℃冰箱中避光浸提 24 h[12，19]。

1.3.3 色素含量及提取量的測定

1.3.3.1 黃瓜皮色素含量的測定

將浸提液置于離心機中離心（8500r/min、10min），取3 mL上清液，用紫外分光光度計，測定在649、665、470nm的吸光度[19]，并根據(jù)下列相關公式計算色素含量，單位為mg/L，公式如下。

式中：Chl a為黃瓜果皮中葉綠素a的含量，mg/L；Chl b為黃瓜果皮中葉綠素b的含量，mg/L；Car為黃瓜果皮中類胡蘿卜素的含量，mg/L。

1.3.3.2 黃瓜皮色素提取量的計算

依照下列公式計算浸提液中黃瓜皮色素的提取量。

黃瓜皮色素提取量/（mg/g）=C×V/m

式中：C為提取液中黃瓜皮色素質(zhì)量濃度，g/mL；V為提取液體積，mL；m為黃瓜皮的質(zhì)量，g。

1.3.4 單因素試驗

根據(jù)1.3.1制備黃瓜皮樣品，分別精準稱取0.1 g進行試驗，按照1.3.2中的提取方法，對黃瓜皮中的色素進行浸提，并依照1.3.3中的方法及公式計算黃瓜皮色素的提取量，通過所得數(shù)據(jù)篩選出各單因素的最適條件。纖維素酶添加量（0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1.0%）、料液比[1 ∶30、1 ∶50 、1 ∶70 、1 ∶90、1 ∶110（g/mL）]、乙醇體積分數(shù)（30%、45%、60%、75%、90%）以及超聲時間（60、90、120、150、180 min）為所檢測的因素。

1.3.5 正交試驗

在單因素試驗的基礎上，對纖維素酶添加量、料液比、乙醇體積分數(shù)、超聲時間4個因素分別取3個平，按照L9（34）正交表進行優(yōu)化組合試驗，正交試驗因素與水平設計見表1。

表1 正交試驗因素與水平設計Table 1 Factors and horizontal design of orthogonal experiments

1.4 統(tǒng)計分析

本研究中所有試驗各重復3次，所有數(shù)據(jù)用平均值±標準差表示，并使用SPSS 19.0軟件進行統(tǒng)計學分析[20-21]。

2 結(jié)果與分析

2.1 纖維素酶添加量對黃瓜皮色素提取量的影響

纖維素酶添加量對黃瓜皮色素提取量的影響見圖1。

圖1 纖維素酶添加量對黃瓜皮色素提取量的影響Fig.1 Effect of cellulase addition amount on extraction rates of pigment about cucumber peel

有研究表明，應用纖維素酶可以降解細胞壁成分，是一種高效溫和的促進色素提取的方法。因為纖維素是植物細胞壁的關鍵組成，因此纖維素酶經(jīng)常被使用。此外，該酶即使在環(huán)境溫度和提取時間較短的情況下也能有效防止色素降解[22]。因此，利用纖維素酶能較充分地提取黃瓜皮中的色素。

由圖1可知，類胡蘿卜素、葉綠素b和葉綠素a的變化情況大致相同，隨著纖維素酶添加量的升高，色素提取量呈現(xiàn)出先增后減的趨勢，當纖維素酶添加量為0.8%時，提取量達到頂點，3種色素提取量分別為132.04（類胡蘿卜素）、66.31（葉綠素 b）、73.35 mg/g（葉綠素a），但當纖維素酶添加量超過0.8%時，色素提取量均下降。這說明，適量添加纖維素酶可以提高黃瓜皮的色素提取量，且纖維素酶添加量為0.8%時，纖維素酶對黃瓜皮的細胞壁破壞最嚴重。魯青等[23]研究當纖維酶添加量為0.2%時，其對火龍果皮中甜菜紅素的提取非常有效，其提取量達到最高（37.22%），該研究表明，火龍果皮的色素提取率與纖維素酶添加量不會呈顯著的正相關，其研究與本研究的結(jié)果一致。酶解反應不徹底是由于纖維素酶添加量過低而引起的，只有適當提高纖維素酶添加量，才能使反應進行徹底，但纖維素酶添加量過大，反而約束酶發(fā)揮其效應[24]。故本研究最適纖維素酶添加量為0.8%。

2.2 料液比對黃瓜皮色素提取量的影響

料液比不同會影響提取液中提取劑的用量，料液比會使傳質(zhì)推動力有所差異，提取劑用量大就會使傳質(zhì)推動力大，則提取更快，提取量更高，因此，料液比對色素提取量有重要的作用。料液比對黃瓜皮色素提取量的影響見圖2。

圖2 料液比對黃瓜皮色素提取量的影響Fig.2 Effect of solid-to-liquid ratio on extraction rates of pigment about cucumber peel

由圖2可知，隨著溶液體積的增大，黃瓜皮的色素提取量先增后減，當料液比為1∶90（g/mL）時，獲得最大提取量，分別為169.12（類胡蘿卜素）、68.04（葉綠素b）、91.81 mg/g（葉綠素 a），當料液比為1 ∶110（g/mL）時，3種色素提取量均下降。張麗等[24]利用纖維素酶輔助超聲波法提取茄子皮中的色素，其研究表明，隨著料液比的降低，茄子皮色素的提取量提升，當料液比為1∶60（g/mL）時達到頂峰，但超過該值，茄子皮色素提取量反而下降，其結(jié)果與本試驗結(jié)果一致。產(chǎn)生上述結(jié)果的原因是由于料液比過大會稀釋色素的濃度，因而會使色素的提取量降低。故本研究中的料液比應控制在 1∶90（g/mL）為宜。

2.3 乙醇體積分數(shù)對黃瓜皮色素提取量的影響

相比于甲醇、丙酮等，乙醇為綠色環(huán)保有機溶劑，不污染環(huán)境且對人體健康無害，提取效率高，價格低廉，因此非常適合用作食品色素提取劑。乙醇體積分數(shù)對黃瓜皮色素提取量的影響見圖3。

圖3 乙醇體積分數(shù)對黃瓜皮色素提取量的影響Fig.3 Effect of ethanol volume fraction on extraction rates of pigment about cucumber peel

由圖3可知，類胡蘿卜素、葉綠素b和葉綠素a的變化趨勢一樣，當其他條件維持不變時，隨著乙醇體積分數(shù)增大，3種色素提取量均顯示出先增后減的結(jié)果。當乙醇體積分數(shù)為75%時，類胡蘿卜素、葉綠素b及葉綠素a的提取量均達到最大值（186.69、69.94、117.34 mg/g）。然而一旦乙醇的體積分數(shù)超過75%，黃瓜皮的色素提取量均降低。該結(jié)果與俞騰飛等[25]報道的乙醇體積分數(shù)對葡萄籽花青素提取的研究相同，說明當乙醇體積分數(shù)超過其適宜范圍時，會導致出現(xiàn)一些醇溶性雜質(zhì)，其與乙醇、水分子等結(jié)合后，會與色素的溶解形成競爭，從而引起色素提取量的降低[19]。上述結(jié)果顯示，乙醇體積分數(shù)為75%時提取色素的效率最佳。

2.4 超聲時間對黃瓜皮色素提取量的影響

據(jù)報道，超聲波在食品加工中的應用可提高色素提取量，因為它能有效地增加傳質(zhì)傳熱。事實上，由于空化現(xiàn)象[26]，隨著細胞壁的破壞和細胞材料的釋放，萃取過程可以得到加強。超聲時間對黃瓜皮色素提取量的影響如圖4所示。

圖4 超聲時間對黃瓜皮色素提取量的影響Fig.4 Effect of ultrasonic time on extraction rates of pigment about cucumber peel

由圖4可知，類胡蘿卜素、葉綠素b和葉綠素a的變化趨勢類似，在其他條件保持恒定時，若超聲時間延長，色素提取量會表現(xiàn)出先增后減的趨勢，超聲時間在120min處可達到最高值。本研究結(jié)果與羅璇等[27]、東子珺等[28]的研究結(jié)果一致，說明超聲時間過長或過短均會對植物的色素提取造成不良影響。若時間太短，則會致使提取不充分，甚至不會激活酶的活性；若時間太長，會導致色素損失，兩者均會降低色素提取效果。綜上所述，超聲時間最好維持在120 min左右。

2.5 正交試驗結(jié)果分析

以各單因素試驗（纖維素酶添加量、料液比、乙醇體積分數(shù)、超聲時間）為基礎，對黃瓜皮的3種色素提取量進行L9（34）正交試驗見表2。

表2 黃瓜皮色素提取的正交試驗結(jié)果Table 2 Results of orthogonal experiments for extracted pigment of cucumber peel

由表2可知，雖然各因素對黃瓜皮色素的提取量趨勢相同，但基于R值，A、B、C、D 4個因素對黃瓜皮色素提取量的影響效果不同，結(jié)果表明，其主次順序為A>C>B>D，即對黃瓜皮色素提取量影響最顯著的是纖維素酶添加量，其次是乙醇體積分數(shù)、料液比，而超聲時間對其色素提取量影響微弱。黃瓜皮色素的最優(yōu)提取工藝條件為A2B2C3D1，在該條件下黃瓜皮色素的提取量分別為137.83（類胡蘿卜素）、69.52（葉綠素b）、76.54 mg/g（葉綠素 a）。

綜上所述，在黃瓜皮色素提取過程中，考慮到成本和提取效果問題，應該選擇在最適合的條件下進行試驗，即纖維素酶添加量0.8%、料液比1∶90（g/mL）、乙醇體積分數(shù)90%、超聲時間90 min。為確保試驗的精準性，對上述最優(yōu)提取工藝條件（A2B2C3D1）進行了3次重復，黃瓜皮的類胡蘿卜素提取量分別為136.92、137.24、138.45 mg/g，平均值為137.54 mg/g；葉綠素b的提取量分別為 69.03、69.24、69.80 mg/g，平均值為69.36 mg/g；葉綠素a的提取量分別為76.00、76.23、76.85 mg/g，平均值為76.36 mg/g，以上數(shù)據(jù)同正交試驗結(jié)果基本一致，因此該正交試驗結(jié)果可信。

3 結(jié)論

本文通過對纖維素酶添加量、料液比、乙醇體積分數(shù)以及超聲時間的綜合優(yōu)化，確定了最佳提取條件為纖維素酶添加量0.8%、料液比1∶90（g/mL）、乙醇體積分數(shù)90%、超聲時間90 min。其影響效果依次為：纖維素酶添加量>乙醇體積分數(shù)>料液比>超聲時間。在此條件下從黃瓜皮中提取得到的類胡蘿卜素含量為137.54 mg/g，葉綠素b含量為69.36 mg/g，葉綠素a含量為76.36 mg/g。分別比優(yōu)化前增加了5.79、3.21、3.19 mg/g。

本研究采用了綠色新型、對人體健康無害的技術——超聲波輔助纖維素酶法提取黃瓜皮中的色素（類胡蘿卜素、葉綠素b、葉綠素a），該法被認為是一種合適的工業(yè)方法，可獲得較高的提取量。此外，從廉價的加工廢棄物中生產(chǎn)天然有價值的著色劑，可能會產(chǎn)生可觀的經(jīng)濟和環(huán)境效益。