一種新型生物活性膜的制備及對鮮切蘋果的保鮮效果

付瑞敏 楊雪 夏鐵騎 王丁 張紅 陳五嶺

摘要：為制備兼具抗氧化和抗菌性能的殼聚糖食品防腐保鮮膜，以殼聚糖（CH）-甘油（GLY）-茶渣提取物（TRE）為原料，制備了一種防腐保鮮活性膜。并在此基礎上采用色度測量、傅里葉變換紅外光譜（FTIR）、掃描電子顯微鏡（SEM）、抗氧化性分析、鮮切蘋果保鮮效果評價和抗菌分析等方法對所得膜的光學特性和理化特征進行了研究。色度測量結果表明，不同濃度的TRE加入會增加活性膜的光澤度;FTIR結果表明，甘油的添加會增強茶渣提取物與殼聚糖之間的相互作用;電鏡觀察結果表明，復合膜的各組件之間具有良好的相容性;抗氧化性分析結果表明，殼聚糖復合茶渣提取物所制備的活性膜具有良好的抗氧化活性，DPPH自由基清除能力為86.6%;鮮切蘋果的保鮮效果評價結果顯示，與對照組相比，活性膜處理可有效維持鮮切蘋果的硬度、維生素C含量及可溶性固形物的含量，延緩了MDA的上升，顯示出了良好的保鮮效果;抗菌性分析結果表明，含有15%甘油和20%TRE的殼聚糖膜抑菌圈最大，抗菌性最強。本研究所制備的活性膜在鮮切水果的防腐保鮮方面有較好的應用前景。

關鍵詞：殼聚糖;茶渣提取物;抗氧化;活性膜

中圖分類號：TS255.3 文獻標志碼：A

文章編號：1002-1302（2022）11-0182-07

收稿日期：2021-12-17

基金項目：國家留學基金委地方合作項目（編號：10006）;河南省科技攻關項目（編號：182102110002）;河南省高等學校青年骨干教師資助計劃（編號：2020GGJS265）;河南省高等學校重點科研項目（編號：21B180002）;河南省教育廳人文社科指導項目（編號：20200040）。

作者簡介：付瑞敏（1981—），女，河南鄭州人，博士，副教授，主要從事農業及食品微生物研究。E-mail：angelaminmin@163.com。

通信作者：陳五嶺，博士，教授，主要從事食品微生物研究。E-mail：wuling.chen@263.net。

食品安全問題始終是當前社會關注的焦點，其中，由微生物原因引起的食品安全問題占了相當大的比重。為防止微生物污染，蔬菜、水果等在采摘后通常需要包被一層防腐保鮮膜，之前的保鮮膜多為聚乙烯，但大量使用會導致資源的消耗和廢棄物的產生，后者會引起嚴重的環境污染。因此，尋找開發安全可降解的環境友好型包裝材料是當前果蔬防腐保鮮領域的研究熱點。鮮切蘋果是將新鮮采后蘋果經切分包裝上市銷售的新型半加工產品。與新鮮采摘后蘋果相比，鮮切蘋果在貯藏中更易染菌和發生褐變，從而導致其品質和商品價值下降。研究表明，水果在貯藏期間的保鮮度與其抗氧化、抗菌等性能密切相關，因而鮮切蘋果貯藏保鮮的技術核心是探索一種包裝設備使其能有效維系鮮切蘋果在貯藏期的保鮮度與抗氧化活性。

茶渣（tea residue，TR）作為茶飲料加工中的副產品，通常被直接廢棄，這不僅造成了環境的污染，也形成了資源的浪費。研究表明，茶渣中富含茶多酚和沒食子酸等生物活性物質。茶多酚作為一種天然多酚類物質，具有抗氧化、抗菌、抗誘變、抗炎和抗癌等功效，在保健品生產加工、食品包裝及疾病的預防治療等領域具有廣泛的應用。

殼聚糖（CH）是一種可降解多糖，以其安全、抗菌、具有較好的延展性和成膜性等特點被廣泛用于食品加工的防腐保鮮。它可作為多酚、水楊酸等生物活性化合物的載體，與這些具備抗氧化性抗菌性的活性物質共同用于食品包裝防腐保鮮活性膜的制備與開發。課題組前期為增強活性膜的抗菌性，將生物拮抗菌與殼聚糖進行相應比例的復配，制備出抗真菌活性較強的活性膜。Kurek等從藍莓或葡萄皮渣中提取多酚并將其同殼聚糖復配，以開發用于食品包裝的生物活性膜，最終獲得易于處理的且抗氧化活性與總酚含量成正比的膜。

在食品包裝領域，茶渣中的沒食子酸可通過與殼聚糖分子形成氫鍵等理化作用方式與殼聚糖結合，從而提高殼聚糖膜的力學特性。因此，將茶渣提取物（tea residue extract，TRE）復合殼聚糖制備防腐保鮮膜，可同時滿足環境友好和增強果蔬抗氧化活性的雙重需求。既有效解決茶渣造成的環境污染，又變廢為寶，提升膜的保鮮效果。

甘油（glycerinum，GLY）因具有高吸水率和低成本的優點已經在食品包裝材料方面得到了廣泛應用。它能夠對各種物理條件、化學條件以及水、pH值、熱、紫外線、日光、靜電場、磁場以及物理化學和微生物特性等刺激作出快速的可逆響應;此外，甘油具有相似于多糖的結構和親水性，故甘油和多糖具備良好的成鍵性，可與其互作形成氫鍵。因此，甘油在食品、傷口敷料以及再生藥物的組織工程等方面均得到了廣泛應用。

為探索一條新的環境友好型食品防腐保鮮路徑，本研究以富含多酚類物質的茶渣提取物（TRE）、殼聚糖（CH）以及甘油（GLY）為原材料，制備一種新型的鮮切水果保鮮膜。采用紅外光譜分析、掃描電鏡觀察、熱重分析、抗氧化性分析、抗菌性分析等方法對所制備膜的結構及特性進行表征研究，并研究該膜對于鮮切蘋果在貯藏期間硬度、維生素C含量及可溶性固形物含量等各項指標的影響情況，以期對該活性膜在鮮切水果防腐保鮮中的應用價值做出探索和評估，從而為新型食品防腐保鮮包裝材料的研發提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與儀器

1.1.1 試驗材料 本研究所用的殼聚糖（分子量為375 ku）、甘油（純度99.0%）、乙酸溶液（純度99.0%）、氫氧化鈉（NaOH，99%）和鹽酸（HCl，36.5%～38.0%）均購自鄭州優吉生物科技有限公司，所有試劑純度均為分析純，使用前無需進行進一步純化。試驗用水均為雙蒸水。本研究抑菌試驗所用的假單胞菌（Pseudomonas sp.）、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）和大腸桿菌（Escherichia coli）均由陜西省微生物研究所饋贈，茶渣取自信陽恒興茶飲品有限公司，蘋果購自陜西白水。

1.1.2 試驗儀器 GY-4型數顯式果實硬度計，購自北京陽光億事達科技有限公司;ATAGO數顯式手持糖度儀，購自廣州市愛宕科學儀器有限公司;UV1800型紫外分光光度計，日本島津生產;傅里葉紅外光譜儀，購自蘇州津工科技有限公司;Xrite 2600d 手持色度儀，購自上海色彩科技有限公司;S4800掃描電子顯微鏡，購自日本日立科學儀器（北京）有限公司;LS192光澤度測試儀，購自深圳林上科技有限公司。

1.1.3 試驗時間與地點 試驗于 2020年9—12月在陜西師范大學微生物工程與技術研究院進行。

1.2 試驗方法

1.2.1 茶渣溶劑萃取

取100 g茶渣低溫干燥，研磨粉碎，將其加入 2 000 mL 體積分數為70%的乙醇溶液，將溶液pH值調整為2，低溫避光萃取12 h。而后將其置于 40℃ 水浴鍋中處理8 h，使用旋轉蒸發儀除去乙醇并濃縮，然后將所得的提取物置于 4℃ 保存以備后用。

1.2.2 殼聚糖-甘油-茶渣提取物（CH-GLY-TRE）膜材料的制備

參照de la Caba等的方法進行生物活性膜的制備，并在此基礎上進行了一些修改。首先，分別將1 g殼聚糖（GH）加入2個各放有100 mL乙酸溶液（濃度為0.1 mol/L）的燒杯中，室溫下攪拌45 min后制成2杯殼聚糖溶液;將10 g和20 g茶渣提取物（TRE）分別加入到這2個燒杯中并做好響應標記，室溫下繼續攪拌30 min后，再往這2個燒杯中分別加入15 g的甘油，室溫下繼續攪拌30min直至溶液CH-GLY（15%）-TRE（10%）和CH-GLY（15%）-TRE（20%）完全均質化。將溶液分別倒入直徑為150 mm的培養皿中，所得產物為膜材料T和T。依照同樣的方法，制備了不含TRE的對照組CH薄膜（C）和CH-GLY（15%）薄膜（C）。

1.2.3 活性膜的色度和光澤度檢驗 參考文獻[12]，使用色差儀測定T、T、C、C的色度值及亮度（L）、紅/綠（a）、黃/藍（b）。測量前使用標準白色校準板進行校準，并按照公式（1）計算色差。

ΔE=（L-L）+（a-a）+（b-b）。（1）

式中：L、a、b分別代表薄膜的亨特系數值，L、a、b分別代表校準板的亨特系數值，L=103.98，a=-5.80，b=9.25。使用光澤儀測量各個活性膜的光澤度，入射角為60°，每個樣品均測量10次。

1.2.4 紅外光譜分析 采用傅里葉變換衰減全反射紅外光譜（ATR-FTIR，光譜范圍為4 000～1 000 cm，分辨率為4 cm）法對T、T、C、C紅外吸收光譜進行分析測定，結合FTIR數據庫結果分析判斷各官能團之間可能存在的相互作用。

1.2.5 掃描電鏡分析 本研究采用S4800掃描電子顯微鏡（SEM）對T、T、C、C等各活性面膜的形貌進行了表征。掃描電壓分別為10、15、20 kV。

1.2.6 抗氧化性分析 參考盧俊宇等的方法，在避光條件下，將DPPH和無水甲醇制備成100 mL體積分數為3%的DPPH-無水甲醇溶液。將復合膜裁成邊長為50 cm的正方形，而后將復合膜浸泡在裝有100 mL 95%乙醇溶液的燒杯中，室溫下浸泡4 d后，將燒杯中溶液攪拌均勻后，取2 mL溶液和 2 mL DPPH-無水甲醇溶液混合，將混合液攪拌均勻并于室溫下沉淀30 min。而后以DPPH溶液為對照，測混合溶液在570 nm處的吸光度，按照公式2計算DPPH自由基清除率（I）。

I=D-DD×100%。（2）

式中：D為DPPH溶液的吸光度;D為樣品溶液與DPPH混合后的吸光度。

取等量的C、C、T、T活性膜將其分別浸泡在裝有100 mL 95%乙醇溶液的燒杯中，稱質量計為m，室溫下浸泡4 d后再稱質量計為m，用公式（3）計算質量損失M。

M=m-mm×100%。（3）

式中：m為各活性膜在浸泡乙醇之前的質量;m為各活性膜在浸泡乙醇之后的質量。

1.2.7 保鮮效果分析 選擇大小新鮮度一致的蘋果將其清洗后，用不銹鋼刀片將蘋果去皮，制成邊長為6 cm的立方體，而后將果塊置于濃度為 0.1 mmol/L 的次氯酸鈉水溶液中，浸泡2 min，然后用自來水沖洗掉殘留的次氯酸鈉，晾干后，隨機分成5組，每組20塊鮮切果，各組處理方法見表1。

將各組的鮮切蘋果予以浸泡涂膜處理，而后將其分裝于市場購買的PE保鮮袋中，將其置于15℃環境下（該環境模擬超市中鮮切水果儲存的恒溫庫）中貯藏6 d。其間，參考文獻[14-17]，每天對各處理組的硬度、可溶性固形物、丙二醛（malondialdehyde，MDA）和維生素C含量進行測定。

1.2.8 抗菌性試驗分析 將假單胞菌、金黃色葡萄球菌和大腸桿菌從固體斜面上轉接至液體培養基中，37℃培養12 h后，分別取1 mL發酵液將其均勻涂布于平板上，采用牛津杯法測定各復合膜的抑菌性能。

1.3 數據分析

采用SPSS 19.0進行數據處理，數據采用“均值±標準差”表示，使用Origin Pro 9.0和Adobe Illustrator 5.0作圖。

2 結果與分析

2.1 各活性膜的光學特性研究

采用色差計和光澤度儀對所制備的T、T、C、C各活性膜進行色差和光澤度測量。由表2可知，沒有添加茶渣提取物的對照組C和C的L值趨于一致，說明是否添加殼聚糖對亮度的影響不大，隨著TRE添加量的增加，T和T組的亮度有了明顯下降，說明TRE含量的增加使膜材料的顏色逐漸加深。相對比不添加TRE的CG-GLY而言，添加了TRE的復合膜其a值和b值均為正值且隨TRE的添加量增大而增大。a代表紅綠指數，其正負值分別代表紅和綠，b代表黃藍指數，其正負值分別代表黃和藍。結果表明，TRE的添加使膜中的紅色和黃色色度增加，這與茶多酚本身所帶的色素有關。此外，薄膜光澤度的高低與復合膜表面的粗糙度有關，具體表現為：光澤度越低，粗糙度越高。表2中所顯示的各個復合膜的光澤度均低于50，表明所制備的活性膜表面不是很光滑，且通過對比各組膜的光澤度，發現TRE和GLY的添加對膜表面的光澤度會有所提升，說明TRE可能同CH發生了一些相互交聯作用，進而對膜表面結構產生了相應的影響。C膜的光澤度高于C，說明GLY的加入對于CH膜的光澤度有所提升，這表明GLY作為塑化劑在CH成膜系統中起到了積極作用。此外，TRE的加入使得膜光澤度有了進一步的提升，參考王博等的研究結論，推測是由于TRE中富含的茶多酚等物質與GLY和CH發生了相互作用，形成了結構較為均一的共聚物。

2.2 紅外光譜分析

由圖1可見，在3 000～3 750 cm之間有1個很寬的條帶，與—OH和N—H的拉伸振動有關。對比CH組，添加了TRE和GLY的復合膜在該處的峰強度有不同程度的增加，表明復合膜中羥基量有所增加。此外，圖中CH-GLY-TRE復合膜在1 640、1 540 cm處出現了O—H、C—O的伸縮振動，說明復合膜中形成了酰胺鍵。此外，FTIR中各復合膜的特征峰表明TRE與CH的反應并未改變CH本身的骨架結構，這與Pasanphan等的研究結果一致。

2.3 SEM結果分析

由圖2可見，構成復合膜的CH、GLY和TRE彼此間具有良好的相容性。由圖2-a、圖2-b可知，當殼聚糖膜中添加甘油時，膜表面變得有些粗糙，出現一些褶皺結構，這是甘油塑化作用所致。圖 2-c、圖2-d顯示，TRE的加入引起活性膜微觀結構的改變，具體表現為添加TRE的活性膜表面變得更光滑和平整，但仍可以清晰地觀察到活性膜表面的纖維結構，推測是TRE中的茶多酚等物質連接到殼聚糖分子上并在干燥處理時填充到了殼聚糖分子所形成的網格間，從而使活性膜的結構更緊致。電鏡結果與光澤度檢測結果一致，說明添加TRE成分有助于提升活性膜的光澤度和平整性。

2.4 抗菌特性研究

由圖3可見，添加了TRE的CH膜，抑菌圈較對照組明顯增大，且抑菌圈直徑隨TRE添加量的增加而增加。因此，綜合各復合膜的抗菌特點，CH-GLY（15%）-TRE（20%）的抑菌效果最好。研究表明，殼聚糖的抑菌機制在于它可與弱酸發生反應形成陽離子生物絮凝劑，絮凝過程中可導致微生物細胞沉聚在一起，同時殼聚糖還可密集分散在細菌細胞表面從而影響菌體對營養物的吸收以及代謝廢物的排出。殼聚糖與茶渣提取物復合制備的活性膜相對比殼聚糖本身而言，其抗菌性增加的原因主要在于茶葉提取物中的茶多酚可增強殼聚糖的脫乙酰化程度，而后者可增強殼聚糖分子鏈上胺基的質子化程度，胺基的質子化程度增高進而會使殼聚糖在稀酸溶液中的帶電基團增多，從而提升殼聚糖的抗菌性能;此外，茶渣提取物中所含的沒食子酸、 茶多酚等物質的羥基可與菌體蛋白的氨基或者羧基發生反應進而發揮抑菌性能。

2.5 抗氧化特性研究

由表3可見，含GLY的薄膜CH-GLY和CH-GLY-TRE其質量損失值均高于不含GLY的薄膜CH，根據相似相溶原理，推測是由于GLY和TRE中的茶多酚等物質發生溶解，進而導致質量明顯下降。

由圖4可見，在抗氧化能力方面，添加TRE復合膜T和T組的DPPH自由基清除率很高，而沒有添加TRE活性膜的C和C組不超過50%。通過對比4組活性膜的抗氧化活性，發現GLY的添加對活性膜抗氧化能力的提升幫助不大，該結果與Choque等的結果一致，甘油的主要作用是提升殼聚糖的彈性，自身不具備清除自由基的能力。

2.6 CH-GLY-TRE對鮮切水果的保鮮效果研究

由圖5-a可以看出，沒經過任何涂膜處理的對照組中鮮切蘋果的硬度下降極其明顯，而與之相對的是，經過茶渣提取復合殼聚糖及甘油涂膜處理的T組和T組的鮮切蘋果在為期6 d的儲藏期內維持了較好的硬度。說明本試驗中所制備的保鮮膜可有效延緩鮮切蘋果硬度的下降趨勢。

丙二醛是果實細胞膜脂受超氧陰離子和羥基自由基的作用所形成的過氧化產物，其含量的升高暗示著果實細胞衰老的加劇。由圖5-b可見，隨著處理時間的不斷延長，各處理組鮮切蘋果的MDA含量均呈現上升趨勢，其中，尤以對照組（CK）上升最為明顯。添加了TRE的處理組（T、T）上升相對更為平緩，且TRE含量高的T組MDA含量較T組低，說明茶渣提取物可通過有效降低果實的過氧化程度來延緩果實衰老。

本試驗中各組鮮切果實的維生素C含量如圖 5-c 所示，由圖5-c可知，隨著貯藏時間的延長，各處理組的維生素C含量均呈現下降趨勢，推測其原因可能是在機械損傷的環境脅迫作用下，果實細胞的生理代謝代償性增強，氧化作用增強進而導致維生素C被氧化分解。對比未經過涂膜處理的CK組，所有涂膜處理的果實其維生素C含量均高于CK，且添加了TRE的T組和T組顯示了較高的維生素C含量，說明茶渣提取物可較好地延緩鮮切蘋果中維生素C含量的下降。可溶性固形物主要是指果實中所含的可溶性糖類，其含量反映了果實的成熟程度。本研究測量了儲藏期間各組處理鮮切果中的可溶性固形物含量，所得結果如圖5-d所示。由圖5-d可知，各處理組的可溶性固形物含量均隨著貯藏時間的延長而呈現不同程度的下降趨勢，其中尤以未經處理的對照組下降最快，而以經CH-GLY（15%）-TRE（20%）活性膜處理的T組下降最慢。結果表明，對鮮切蘋果進行涂膜處理可有效延緩儲藏期間果實的硬度、維生素C含量和可溶性固形物含量的下降以及MDA含量的上升。

3 討論與結論

本研究以殼聚糖（CH）、甘油（GLY）和茶渣提取物（TRE）為原料，制備了用于鮮切水果包裝的生物活性膜，并對活性膜的光學特性、抗菌特性和抗氧化特性進行了分析研究，并對鮮切蘋果的保鮮效果做出評價。光學特性檢測結果發現在CH中加入GLY和TRE可提升活性膜的光澤度，FTIR和SEM檢測結果顯示TRE可通過分子間的相互作用與CH和GLY形成的復合膜相連接;抗菌性能和抗氧化性能試驗結果表明，TRE的添加有助于活性膜抗菌性能和抗氧化活性的提升。評價各處理組對鮮切蘋果的保鮮效果，結果顯示，添加TRE的活性膜對維持鮮切蘋果的硬度、維生素C含量和可溶性固形物含量和硬度均具有較好的效果。

在蘋果貯藏期間，果實中的纖維素和果膠等物質的分解和果實中水分的蒸發均會導致果實硬度的下降，因此，可通過測量果實的硬度來反映果實的衰老程度。通過測定各處理下鮮切蘋果的硬度指標發現，不經任何涂膜處理的對照組中蘋果的硬度下降很快，儲藏至第6天其硬度就已經降至6 N以下。Harker等報道，果實硬度低于6 N，則該果實就不再具備商業價值，對鮮切果予以殼聚糖處理（C組）后等到第6天果實硬度才低于6 N，說明殼聚糖處理對延緩果實衰老具有一定的功效，這與筆者所在課題組前期所得結果一致。殼聚糖結合甘油處理組（C組）對于鮮切果的硬度影響與單獨殼聚糖處理趨于一致，但硬度維系效果優于C組，說明殼聚糖與甘油相互交聯形成的物理屏障有助于延緩鮮切果衰老。其中，添加了茶渣提取物（TRE）的處理組T和T的果實硬度下降最小，說明茶渣提取物中的活性成分能有效延緩果實的軟化速度。造成鮮切果實軟化的原因大致有果實自身生理代謝和微生物感染2類。其中，鮮切蘋果因切分處理所致的機械損傷而引發果實內部呼吸作用及酶促褐變等生理代謝過程出現代償性增加，這會增加果膠的液化和細胞壁的破壞，進而導致果實軟化。茶渣中有茶多酚、沒食子酸等抗氧化活性成分，它們可通過降低鮮切果實酶促褐變、抑制腐敗菌繁殖等方式降低果膠及纖維素等成分的水解和液化，從而維持果實硬度。

丙二醛是果實細胞膜脂受超氧陰離子和羥基自由基的作用所形成的過氧化產物，通常在果實受到凍傷、病害或機械損傷等脅迫時產生。對于帶有機械傷口的鮮切蘋果，其MDA的積累量可作為果實衰老度的重要指標，其含量的升高暗示著果實細胞膜脂過氧化程度以及細胞膜損傷程度的升高，即暗示著果實細胞的衰老加劇。丙二醛含量測定試驗中，發現各處理組中鮮切蘋果的MDA值的增勢是隨TRE添加量的增加而遞減的，推測其原因一方面是由于茶渣提取中含有的多酚抗氧化物質降低了果實膜脂的過氧化作用;另一方面是由于活性膜中的殼聚糖通過與甘油的交聯阻礙了鮮切果實與氧氣的接觸，進而通過降低鮮切果實的呼吸而減弱果實脂質的過氧化作用。

維生素C是蘋果中富含的一種營養成分，作為一種抗氧化劑，它可有效清除果實內活性氧，進而幫助果實延緩衰老。故維生素C含量的測定通常也是衡量蘋果果實衰老程度的指標。本研究中通過對比各處理組鮮切蘋果的維生素C含量，發現添加了TRE的T組和T組顯示了較高的維生素C含量，說明茶渣提取物可較好地延緩鮮切蘋果中維生素C含量的下降，推測其原因是由于茶渣提取物中富含較多的酚羥基，這些酚羥基可減弱果實的氧化作用從而對維生素C起到了保護作用。

可溶性固形物主要是指果實中所含的可溶性糖類，其含量反映果實的成熟程度。本研究對比各處理組果實中的可溶性固形物含量，發現隨著儲藏時間的延長，各處理組果實中可溶性固形物均呈不同程度的下降趨勢，從高到低依次為CK>C>C>T>T。這是由于鮮切蘋果的加工過程會給蘋果果實造成一定程度的機械損傷，后者會導致蘋果果實內部的呼吸作用急速增強，進而導致可溶性糖類大量消耗，故造成各處理組鮮切果實內部可溶性固形物含量均呈下降趨勢。此外，在各處理組中添加了TRE的T組和T組的果實可溶性固形物含量下降趨勢最為緩慢，可能是因為茶渣提取物中的沒食子酸等物質一定程度上抑制了果實的呼吸作用及生理代謝，使其糖消耗量下降。因此，添加TRE的活性膜可有效延緩鮮切蘋果貯藏期間可溶性固形物的損耗，使其在貯藏期間保持良好品質。總之，本研究所制備的活性膜具有成本低廉、操作簡便、保鮮效果顯著等優點，該方法在食品活性膜的加工制備以及果蔬的防腐保鮮等方面具有廣闊的應用前景。

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