結核桿菌Th優勢表位肽促進人DC成熟及T細胞分化的研究

汪夢真 周宇 李翠 李可意 李世杰 洪亮 黃新亮

摘要：目的：探究DC負載Th優勢表位肽促進人DC成熟及T細胞分化。方法：分離外周靜脈血得單核細胞、以細胞因子IL-4和GM-CSF刺激獲得DC，實驗組以DC負載結核桿菌的Th優勢表位肽（10 ug/mL）制備疫苗、對照組DC不負載表位肽，培養8天后流式儀鑒定DC的成熟度（表達CD40、CD80、HLA-DR的DC百分率）。各組DC和自身淋巴細胞按照1：20比例混合4天后，以流式儀鑒定T細胞首次分化的效應CD4+T。再以Th優勢表位肽刺激淋巴細胞2天后流式儀鑒定T細胞再次分化的效應CD4+T。結果：實驗組比對照組表達CD40、CD80、HLA-DR的DC細胞百分率升高，差異有顯著性（p<0.05）;T細胞首次分化的效應CD4+T百分率、T細胞再次分化的效應CD4+T百分率升高，差異有顯著性（p<0.05）;且T細胞再次分化的效應CD4+T比T細胞首次分化的效應CD4+T百分率升高，差異有顯著性（p<0.05）。結論：結核桿菌Th優勢表位肽刺激人DC后，能促進人DC成熟及T細胞分化。

關鍵詞：結核病;樹突狀細胞;表位肽;淋巴細胞;疫苗

【中圖分類號】 R52 【文獻標識碼】 A? ? ? 【文章編號】2107-2306（2022）12--02

結核分枝桿菌（MTB）是引起結核病的病原體，結核病是一種嚴重危害人類健康的慢性感染性疾病。自2006年以來全世界每年有近900萬或以上的新發病例，2014年全球新發結核病人960萬人，死亡150萬人。我國是22個結核病高發國家之一，患病人數位居全球第二[1]。近年來，由于人口流動加速、免疫抑制藥廣泛應用、艾滋病的不斷蔓延及卡介苗免疫效率低下等，我國結核病的發病率依然居高不下，發病總人數呈現上升勢頭，結核病疫情形勢非常嚴峻[2]。全球近1/3人感染MTB，其中有90%的人處于潛伏感染狀態。

目前仍不清楚結核桿菌誘導的確切免疫機制。已知記憶性T淋巴細胞表達細胞膜分子CD45RO和某些粘附分子;記憶性T細胞再次遇到同一抗原時，能夠產生快速而強烈的免疫應答，在抵抗微生物感染和抗腫瘤中發揮了關鍵性作用;它比非記憶細胞免疫功能更強大且壽命更長，是機體抗結核免疫的基礎，但其確切的免疫機制尚不清楚[3，4]。現在臨床實驗室診斷結核桿菌感染的結核桿菌標本陽性率不高;常規為結核菌素皮膚試驗，由于采用純化蛋白衍生物作為抗原，包括卡介苗和非結核分枝桿菌抗原存在廣泛交叉反應而且檢測結果有較高的假陽性和假陰性[5]從而限制TST的臨床廣泛應用。診斷結核感染的另一種常用方法是結核特異性T細胞免疫γ-干擾素釋放試驗，但其診斷的敏感性與特異性差異較大，且試劑價格昂貴、操作復雜[6-7]。

綜上，疫苗仍是控制結核病流行的最佳策略[1]：亞單位疫苗的保護效果優于卡介苗、將可能成為卡介苗的理想替代品[8]。已知結核桿菌有多種抗原表位肽，查詢最近的結核數據庫、表位數據庫、HLA基因頻率數據庫發現，Rv0934（350-364）的表位QVHFQPLPPAVVKL（表位肽2）屬于HLA-DRB1*0901限制性Th細胞表位，而HLA-DRB1*0901等位基因在中國人群頻率最高，能夠覆蓋最廣泛的中國人群。利用流式細胞術，檢測到了表位肽2夠誘導肺結核患者產生同時分泌兩種或以上細胞因子的多功能CD4+T細胞。且這種表位肽能激發更強大的免疫效應，成為優勢表位肽[9]。確定T細胞表位，對表位疫苗設計、結核診斷試劑開發具有十分重要的意義[1]。目前樹突狀細胞（DC）的無動物血清培養技術已經成熟。德國美因茨大學（Mainz University）的Jonuleit等發現TNF-a、IL-1b和IL-6 3種CK（細胞因子）組合后，在無牛血清培養體系中能夠將未成熟DC誘導成完全成熟的DC，避免了動物血清培養DC對人產生的毒副作用[3，9]。本文以DC負載結核桿菌優勢表位肽為基礎，進一步總結其促進人DC成熟及T細胞分化功能，以期深入探究結核病的新型防治措施。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1研究對象實驗組和對照組各6例，平均年齡21歲，經健康體檢無其他發病史，兩組年齡及性別差異均無統計學意義。

1.1.2主要試劑人外周靜脈血、無血清AIM-V培養液、DC表面標志分子CD40、CD80、HLA-DR的熒光素PE標記抗、IL-2、IL-4、IL-1b、TNF-α、IL-6、GM-CSF、FITC熒光素標記的抗人CD3單克隆抗體和PE標記的抗人CD4抗體（Biolegend公司）、Th優勢表位肽DQVHFQPLPPAVVKL（武漢強耀生物科技有限公司合成）。

1.2方法

1.2.1制備DC疫苗

取實驗組外周靜脈血分離人外周血單個核細胞，并置于6孔板中，在37℃、含5%CO2的培養箱中培養3 h;6孔板中貼壁的為DC（收集未貼壁的細胞并且凍存，以便后期和DC混合培養）。向6孔板中加入100 ng/mL GM-CSF、100 ng/mL IL-4，加3 mL/孔無血清AIM-V培液。第3天DC中加入Th優勢表位肽（10 ug/mL），并加入：TNF-a 10 ng/mL、IL-1b 10 ng/mL、IL-6 1000 U/mL。對照組以DC為對照，不加入Th優勢表位肽，其余步驟相同。

1.2.2 DC負載Th優勢表位肽疫苗的成熟度鑒定

倒置顯微鏡觀察DC疫苗的形態變化、用臺盼藍染色檢查細胞存活率。收集第8天的DC并用流式細胞儀檢測各組DC表面標志分子CD40、CD80、HLA-DR。

1.2.3 T細胞的活化

各組DC計數，以1×106/mL作為刺激細胞，按DC：淋巴細胞=1：20的比例，讓DC和復蘇凍存的淋巴細胞混合，37℃置于5%CO2的培養箱中培養4天。

1.2.4 T細胞分化的鑒定

倒置顯微鏡觀察淋巴細胞的形態變化、用臺盼藍染色檢查淋巴細胞存活率。檢測各組CD4+T細胞百分率：在每孔100 uL PBMC細胞懸液中，加入5 uL PE標記的抗人CD3克隆抗體、5 uL FITC標記抗人CD4單克隆抗體，4℃避光染色30 min，以流式細胞儀C6檢測。

1.2.5再次誘導T細胞的活化

對各組再次誘導自身淋巴細胞：以微量移液管加Th優勢表位肽10 ug/mL于細胞中培養2天。

1.2.6再次誘導后分化的淋巴細胞的鑒定

以倒置顯微鏡觀察淋巴細胞的形態變化、用臺盼藍染色檢查淋巴細胞存活率，并以流式細胞儀C6檢測各組CD4+T細胞百分率。

1.3統計學分析

計量資料以均數±標準差（x±s）表示，兩組比較用t檢驗，SPSS17統計數據。

2結果

2.1實驗組和對照組表達CD40、CD80、HLA-DR的DC百分率

實驗組比對照組表達CD40、CD80、HLA-DR的DC百分率顯著升高（p<0.05）。見表1，實例如圖1。DC形態實例如圖2。

2.2實驗組和對照組T細胞首次分化的效應CD4+T百分率

實驗組DC首次誘導的效應CD4+T百分率（即實驗組T細胞首次分化的效應CD4+T百分率）比對照組顯著升高，差異有統計學意義（p<0.05）。見圖3。實例如圖3。CD4+T形態如圖5。

2.3實驗組和對照組T細胞再次分化的效應CD4+T

實驗組DC再次誘導的效應CD4+T百分率（即實驗組T細胞再次分化的效應CD4+T百分率）比對照組顯著升高，差異有統計學意義（p<0.05）。見圖6，實例如圖7。CD4+T形態如圖8。實驗組和對照組DC再次誘導的效應CD4+T百分率的參考值見表2。

2.4 T細胞再次分化的效應CD4+T百分率和首次分化的效應CD4+T百分率

DC再次誘導的效應CD4+T百分率比首次誘導的效應CD4+T百分率顯著升高，差異有統計學意義（p<0.05）。見圖9。

3討論

目前DC的無動物血清培養技術業已成熟，防治結核病的新型疫苗適宜在無動物血清培養技術下進行制備。以TNF-a、IL-1b和IL-6三種細胞因子組合后，在無牛血清培養體系中能夠將未成熟DC誘導成完全成熟的DC，避免了動物血清培養DC對人產生的毒副作用[8]。Th優勢表位肽是結核桿菌抗原Rv0934（350-364）的表位肽DQVHFQPLPPAVVKL、屬于HLA-DRB1*0901限制性Th細胞表位，能被CD4+T識別。而HLA基因頻率測試發現HLA-DRB1*0901等位基因在中國人群的頻率最高。因此，疫苗一旦開發成功，適用人群廣泛。因而本研究為體外構建結核疫苗提供了方便的安全的培養環境。

結核病的免疫機制中可能存在多種Th細胞的活化、分化和效應[3]。本文總結了檢測CD4+T細胞的體外簡易方法，若進一步通過臨床研究、制定DC再次誘導后的CD4+T細胞的數量參考值范圍，亦可據此評估患者的免疫功能。例如已知結核病為有菌免疫，若受檢者該百分率高于正常值，可作為個體免疫功能增強及結核病的病因學診斷的依據;還可據此判斷個體結核病預防或治療效果的動態變化。

結束語

綜上，結核桿菌Th優勢表位肽刺激DC，能促使DC細胞成熟度增加，DC負載的結核桿菌Th優勢表位肽誘導T細胞分化為效應CD4+T百分率上升、且再次誘導的效應CD4+T比DC首次誘導的效應CD4+T百分率升高。據此有望探索出基于臨床前期結核病的新型防治方法：用DC負載結核桿菌Th優勢表位肽的疫苗誘導外周血中T細胞，能增強機體抗結核桿菌的細胞免疫功能。

參考文獻：

[1]WHO Global Tuberculosis Report 2015.Geneva：World Health Organization 2015.

[2]Cardinale L，Parlatano D，Boccuzzi F，et al.The imaging spectrum of pulmonary tuberculosis[J].Acta Radiologica，2015，56（5）：557-564.

[3]劉昀，吳長有，記憶性T細胞的形成、維持和功能[J].生命科學，2010，22（6）：506-509.

[4]Y.Zou，H.Zhu，M.Pan.995 Identification of CD4+CD69+tissue-resident memory T cell in pemphigus lesions[J].Journal of Investigative Dermatology，2019，139（5）：124-132.

[5]Le Palud P，Herrmann JL，Bergot E.Interferon gamma release assay（IGRA）tests[J].Rev Mal Respir，2018，35（8）：862-865.

[6]Al-Zamel FA.Detection and diagnosis of Mycobacterium tuberculosis[J].Expert Rev Anti infect Ther，2009，7（9）：1099-1108.

[7]婁加陶，吳傳勇，陳燕，等.結核桿菌抗原Rv0173的HLA-A*0201限制性CTL表位的預測及鑒定[J].中國實驗診斷學，2007，11：1444-1447.

[8]劉蘇東.結核分枝桿菌免疫優勢CTL和Th1表位的篩選與鑒定[D].南方醫科大學，2016.

[9]? Jonuleit H， Kuhn U， Muller G. Pro-inflammatory cytokines and prostaglandins induce maturation of potent immunostimulatory dendritic cells under fetal calf serum-free conditions[J]. European journal of immunology，1997，27：3135-42.

基金項目：2021年安徽省大學生創新創業訓練計劃項目（S202110368043）

作者簡介：汪夢真（2002-01）女，漢，安徽，本科學生，研究方向：衛生檢驗與檢疫。