熒光定量PCR測定新型冠狀病毒核酸Ct值測量不確定度的評定與應用探討

雷務年 潘曉梅 利瑾玲

摘要：目的 探討熒光定量聚合酶鏈式反應（PCR）測定新型冠狀病毒核酸（2019-nCoV）Ct值的測量不確定度的評定在新型冠狀病毒病肺炎防控工作中的應用價值。方法? 一、采用定值質控品（稀釋成750copies/ml使用）一次性做20個平行樣和每天一次提取和擴增檢測連續20天，并建立不確定度報告模型，分別得到的Ct值標準差作批內或批間評定A類不確定度;二、根據所使用檢測器具提供的信息所獲得的數據，評定B類不確定度;根據A類和B類不確定度結果確定合成不確定度和擴展不確定度;結果 750copies/ml質控品的擴展不確定度分別為 ORFlab基因為Ct（lab）=33.53±3.53? （k=2? p=95%）;N基因的擴展不確定度為 Ct（N）=35.80±3.80 （k=2? p=95%）;結論 熒光定量（PCR）測定（2019-nCoV）核酸Ct值引入擴展不確定度在一定范圍內，有助于相關人員準確使用實驗室給予的Ct值不確定度對疑似病人、無癥狀感染者作出準確判斷以及病人出院后的監測管理，做出精準防控。

關鍵詞：測量不確定度;熒光定量聚合酶鏈式反應（PCR）;（2019-nCoV）核酸;Ct值

【中圖分類號】 Q345+.24 【文獻標識碼】 A? ? ? 【文章編號】2107-2306（2022）12--01

熒光定量聚合酶鏈式反應（PCR）測定2019-nCoV核酸，是目前最常用的新型冠狀病毒病肺炎檢測方法[1-2]。作為判定檢測結果的Ct值，其定義是熒光信號開始由本底進入指數增長階段的拐點所對應的循環次數。《新型冠狀病毒肺炎診療方案》（試行第九版）[3]將Ct值≥35作新冠病人出院的標準。Ct值與其他量值測量一樣，也會存在不確定度。ISO 15189《醫學實驗室質與能力的要求》[4]、中國合格評定國家認可委員（CNAS）最新發布的（CNAS-CL01-G003）《測量不確定度的要求》[5]除了對不確定度評定提出要求外，還強調實驗室應該提供檢測結果的不確定度，在適用時檢測報告應報告檢測結果的不確定度。熒光定量PCR法由于檢測靈敏度高，同一或不同實驗室的檢測結果可比性還不能保證，建立量值溯源可使檢測結果達到一致性[6]。在基因定量檢測中，檢測結果的不確定度評定已有諸多報導[7-8]。本文針對熒光定量PCR法檢測2019-nCoV核酸時，對檢出的Ct值給予測量不確定度評定。為保證實驗室生物安全，使用陽性定值質控品替代陽性樣品進行模擬檢測，現報告如下：

1材料與方法

1.1材料? 批內和批間重復性的實驗，采用陽性質控品（廣東和信，批號2021082），凍干粉，按照說明書保存于2-8℃冰箱中，稀釋成750copies/ml后使用。

1.2試劑與儀器 提取試劑為西安天隆的試劑盒，擴增試劑為達安基因的熒光定量PCR 2019-nCoV 核酸檢測試劑盒，GenRotex 96核酸提取儀和Gentier 96E熒光定量PCR分析儀為西安天隆的品牌。操作按試劑說明書進行。

1.3 測量不確定度的評定

3.討論

熒光定量PCR法是目前檢測新型冠狀病毒感染的首選方法，該方法具大通量，檢測快，準確度高等優點[9]。Ct值是判讀“陰陽”性及出院標準的量值指標[3]。不同檢測單位的檢測結果往往會存在一定的偏差，如果僅以單一Ct值來判定，由于測量不確定度的存在，不同檢測機構甚至是同一個檢測機構使用不同檢測試劑同時檢測同一份標本，當Ct值處于陰陽性判定或出院標準Ct值的臨界值時，就有可能呈現截然相反的兩種檢測結果，不利于檢測結果判斷和解釋。如果對檢測的Ct值進行不確定度的評定，在結果報告中附上Ct值及其不確定度，使檢測數據更可靠，也增加了檢測結果之間的可比性。有助于檢驗人員、臨床醫師、防控人員等根據Ct值和受檢者的臨床癥狀及流調情況進行綜合研判，做出精準防控，也很好的避免爭議。

誠然，熒光定量PCR法檢測2019-nCoV）核酸受到諸多因素的影響，檢測前、中、后的因素均可導至假陽性[10]，采樣管液量、采樣部位、手法、檢測后的人工基線和閾值調整等均可對檢測結果產生影響。不同的檢測試劑盒性能偏差[11]，所用的儀器品牌、型號等，也可能導致檢測結果不同，只是目前還不能通過量化的不確定度數據進行評定。我們只有制定規范的SOP文件，嚴格要求檢測人員遵守SOP文件規定，從采樣開始到檢測結果Ct值的基線或閾值的調整均按SOP文件規范執行，這樣或能減少這些無法量化的不確定度。

對臨床檢驗數據開展測量不確定度的評定，是臨床實驗室提高出具檢驗結果可靠性的重要保障，是臨床檢驗工作科學性和準確性的體現，也是臨床實驗室專業技術水平高低的體現。

參考文獻：

[1] 中華醫學會檢驗醫學分會. 2019新型冠狀病毒核酸檢測專家共識 [J] . 中華醫學雜志，2020，100 （13）： 968-973.

[2] 中華人民共和國國家衛生健康委員會.新型冠狀病毒感染的肺炎實驗室檢測技術指南（第三版）[EB/OL].2020-01-28.

[3] 中華人民共和國國家衛生健康委員會.新型冠狀病毒感染的肺炎治療方案（試行第九版）[EB/OL].2022-03-24.

[4] International? Organization? for Standardization ISO 15189 .Medical laboratories particular requirements for qualify and competence [S].Geneva：Switzerland，ISO，2012.

[5] Clinical and Laboratory Standards Institute.CLSI C 51-A.Expression of measurement uncertainty in laboratory medicine [S]. Wayna： PA CLSI 51-A，2012.

[6] 李育敏，徐怡，闞麗娟等，.熒光定量PCR測定HBV DNA測量不確定度的評定與應用探討[J].現代檢驗醫學雜志，2019，34（03）：151-155.

[7] 熊娟，黃啟紅，伍玲燕，蔡大川，張志軍，黃璇瑩，陳敏兒.實時熒光定量PCR檢測轉基因玉米Bt176測量不確定度分析[J].安徽農業大學學報，2017，44（01）：119-123.DOI：10.13610/j. cnki. 1672-352x. 2017 0208.023.

[8] 劉偉平，楊新春，殷明剛.HBV-DNA實時熒光定量檢測程序的測量不確定度評估及分析[J].國際檢驗醫學雜志，2019，40（01）：59-61.

[9] 鐘慧鈺，趙珍珍，宋興勃，等.新型冠狀病毒核酸臨床檢測要點及經驗[J].國際檢驗醫學雜志，2020，41（05）：523-526.

[10] 侯盼飛，潘艷，祝麗晶，等.新冠病毒核酸檢測中假陽性問題分析[J].中國國境衛生檢疫雜志，2021，44（05）：373-374.DOI：10.16408/j.1004-9770.2021.05.022.

[11] 宋月娟，楊淑娟，馬騰，等.新型冠狀病毒4種熒光定量PCR檢測試劑的檢測性能分析 [J].西南國防醫藥，2020，30（12）：1073-1076.