HPLC法測定小兒肺咳顆粒中橙皮苷含量的不確定度評估

王宇 張玉玲 鄒丹

摘要：目的： 評定 HPLC 法測定小兒肺咳顆粒中橙皮苷含量的不確定度。方法： 建立 HPLC 法測定含量的數學模型，分析測量不確定度的來源并對各分量進行量化分析和評估，合成標準測量不確定度，給出擴展測量不確定度報告。結果： 小兒肺咳顆粒中橙皮苷含量的不確定度為0.02mg，測量結果表示為（ 1.26 ±0.02） mg，（k = 2）。結論： 分析產生不確定度的主要來源，可為有效地控制該含量測定方法的準確性提供可靠的理論依據。

關鍵詞：高效液相色譜法;小兒肺咳顆粒;橙皮苷;不確定度

【中圖分類號】 R722.13+5 【文獻標識碼】 A? ? ? 【文章編號】2107-2306（2022）12--02

1 實驗部分

1.1儀器與試藥

Agilent 1100 型 HPLC 儀; MSA6.6S-CE型電子天平（賽多利斯 d=0.001mg）;ME204/02型電子天平（梅特勒 d=0.1mg）;

小兒肺咳顆粒（吉林省某藥廠，批號：20210121）

橙皮苷對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號：110721-202019，含量95.3% ）;甲醇（色譜純，美國Fisher公司），其余試劑為分析純，水為超純水。

1.2? 實驗方法

（ 1） 色譜條件與系統適用性試驗。色譜柱：島津 Wondaisil C18（ 250 mm × 4.6 mm，5μm）;流動相： 甲醇-5%醋酸溶液（33：67）;流速： 0.8 ml/min; 檢測波長： 283nm; 柱溫： 35℃;進樣量： 5μl。理論板數按橙皮苷峰計算應不低于3000。

（ 2） 測定法。取小兒肺咳顆粒10袋，研細，取約3g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇50ml，稱定重量，超聲處理（功率80W，頻率250kHz）30分鐘，放冷，再稱定重量，用甲醇補足減失的重量，搖勻，濾過，取續濾液，作為供試品溶液。另取取橙皮苷對照品適量，精密稱定，加75%甲醇制成每1ml含30μg的溶液，作為對照品溶液。精密吸取對照品溶液與供試品溶液各10μl，注入液相色譜儀，測定，按外標法計算小兒肺咳顆粒中橙皮苷的含量。

2 測量不確定度的分析

2.1 測量不確定度的構成及相對合成標準不確定度的數學表達式

根據 HPLC 外標法以峰面積計算含量的基本原理，小兒肺咳顆粒中橙皮苷含量的數學表達式為：

式中：P為供試品中橙皮苷的含量（mg/g）;Wx為供試品的質量（g）; P純為對照品的純度（%）;Ws為對照品的質量（mg）;Ax為供試品中橙皮苷峰面積;

As為對照品中橙皮苷峰面積;Vx稀為供試品的稀釋倍數;Vs稀為對照品的稀釋倍數;Vx進為供試品溶液的進樣體積（μl）;Vs進為對照品溶液的進樣體積（μl）。

2.2 識別測量不確定度來源

2.3 測量不確定分量的量化分析

2.3.1? HPLC進樣重復性的相對不確定度urel（Frep）

屬于A類不確定度。為獲得可靠性較高的標準偏差，本次測定了10份樣品中橙皮苷的含量，結果見表1。

單次測量的重復性標準偏差按照貝塞爾公式計算：s（x）=1.77%，本次HPLC進樣重復性的相對標準不確定度

2.3.2? 對照品溶液濃度相對標準不確定度urel（C對）

2.3.2.1? 對照品純度的相對標準不確定urel（P對）

屬于B類不確定。按橙皮苷對照品的說明書標示，純度為95.3%，對照品說明書未給出不確定度，假定其分布區間為±0.05%，按矩形分布換算，對照品純度的相對標準不確定度為：urel（p純）=α/k/95.3%=0.05%//95.3%=3.03×10-4。

2.3.2.2? 對照品稱量的相對不確定urel（Ws）

（1）天平示數引入的不確定度u1（W對）

天平檢定證書給出天平（ d = 0.001 mg）的最大允許誤差為±0.002mg，按矩形分布計算，u1（W對）=α/k=0.002/=1.15×10-3mg。

（2）天平重復性引入的不確定度u2（W對）

天平檢定證書給出天平（ d = 0.001 mg）重復性誤差為0.002mg，按矩形分布計算，u2（W對）=α/k=0.002/=1.15×10-3mg。因試驗時采用減重法，

稱取對照品的質量分別為W對1=6.658mg，W對2=6.684mg，對照品稱樣量的相對標準不確定度分別為：u（W對1）=u（W對）/W=2.30×10-3/6.658=3.45×10-4，

u（W對2）=u（W對）/W=2.30×10-3/6.684=3.44×10-4，故對照品稱量的相對標準不確定度為：

2.3.2.3 對照品稀釋引入的相對標準不確定度urel（V對）

校準引入的不確定度u1（V對200）

200mlA級容量瓶的最大允許誤差為±0.15ml，按矩形分布計算，則：u1（V對200）=α/k=0.15/=8.66×10-2ml。

溫度引入的不確定度u2（V對200）

定容在21℃下進行，量瓶校正溫度T0=20℃，水的體積膨脹系數為2.1×10-4/℃。按矩形分布計算，u2（V200）=α/K=200×2.1×10-4×（21-20）ml/=2.42×10-2ml。由以上2項合成得相對標準不確度

urel（VS）= /200=4.50×10-4 ml

2.3.3 供試品溶液濃度的相對標準不確定度urel（C樣）

2.3.3.1? 供試品稱量的相對標準不確定度urel（W樣）

（1）天平示數引入的不確定度u1（W樣）

天平檢定證書給出天平（ d = 0.1 mg）的最大允許誤差為±0.5mg，按矩形分布計算，u1（W樣）=α/k=0.5/=0.289mg。

（2）天平稱量重復性不確定度

天平檢定證書給出天平（ d = 0.1 mg） 的重復性誤差為1mg，按矩形分布計算，u1（W樣）=α/k=1/=0.577mg。因稱量過程中使用減量法，故其不確定度為。稱取10份樣品的平均值為3.0584g，其相對標準不確定度為urel（W樣）=u（W樣）/W樣=0.913/3.0584×10-3=2.99×10-4。2.3.3.2 供試品溶液稀釋引入的相對標準不確定度urel（V樣）

（1）校準引入的不確定度u1（V樣50）

50mlA級移液管的最大允許誤差為±0.05ml，按矩形分布計算，則：u1（V樣50）=α/k=0.05/=2.89×10-2ml。

（2）溫度引入的不確定度u2（V樣50）

定容在21℃下進行，移液管校正溫度T0=20℃，水的體積膨脹系數為2.1×10-4/℃。按矩形分布計算u2（V50）=α/K=50×2.1×10-4×（21-20）ml/=6.06×10-3ml。由以上2項合成得相對標準不確度

urel（V樣）=/50=5.90×10-4 。

2.4 計算合成相對不確定

可知合成標準不確定度是：

2.5 擴展不確定度? 測量結果符合正態分布，取置信概率為 95%，包含因子

2.6 測量不確定度報告

3 討論

本文通過對 HPLC 法測定小兒肺咳顆粒中橙皮苷含量的測量不確定度評定，分析了各測量不確定度分量。由分析結果可知，最大的測量不確定度來源于對照品的稱取量，提示今后進行小兒肺咳顆粒含量測定試驗時，可增加對照品的取樣量，降低對照品稱量時引入的不確定度，增加測定結果的準確性。本文所建立的評估方法可為同類型的藥物含量的不確定度分析提供參考。

參考文獻：

1 國家質量監督檢驗檢疫總局.測量不確定度的評定與表示[S]：JJF1059.1-2012

2 中國藥典[S].2020 年版.一部.563

3 左毅，費路華.HPLC 法測定甲硝唑片含量的測量不確定度評定[J].中國藥師，2015，18（ 09）： 1612-1614

通訊作者：劉匯? 副主任藥師? ?延邊州食品藥品檢驗所