膠原蛋白提取及檢測方法研究進展

張華 湯振業(yè) 趙浩然 儲李捺 孫廣冬

摘要：目前，隨著膠原蛋白在各相關行業(yè)中用量不斷增加，人們對其的研究愈發(fā)重視。膠原蛋白主要存在于水生動物和哺乳動物體內，經(jīng)專業(yè)手段提取后應用于食品、美容、醫(yī)療等領域中。本文主要就其提取方法和檢測方法展開綜述，旨在為今后的相關研究提供有力依據(jù)。

關鍵詞：膠原蛋白;提取方法;檢測方法

【中圖分類號】 G644.5 【文獻標識碼】 A? ? ? 【文章編號】2107-2306（2022）12--01

膠原蛋白主要分布于多細胞生物體內，是其中含量最多且分布最為廣泛的蛋白質之一，在蛋白質總量中占比約在25%—35%，是締結組織的主要組成部分[1]。一般情況下，膠原蛋白提取來自于動物屠宰后的廢棄物。此外，魚皮也是其主要原料之一。膠原蛋白不僅具有良好的理化性能和生物活性，同時還具備其他材料無可比擬的優(yōu)勢，那就是較高的生物相容性和可降解性。正是由于其具備的這些獨特優(yōu)勢，使其被大量應用于醫(yī)藥、美容、食品加工等行業(yè)中。隨著各行各業(yè)對膠原蛋白需求量的不斷增加，人們對其的研究也在逐步深入。本文主要就膠原蛋白的提取及檢測展開綜述。

1.膠原蛋白的提取方法

人們主要通過海洋生物和動物組織獲得生產(chǎn)膠原蛋白的原材料，包括禽畜骨頭、肌腱、豬皮、魚鱗、魚皮等。而目前普遍認為品質最佳且污染較小的就是深海魚膠原蛋白，這也是膠原蛋白提取由動物組織逐漸轉向海洋生物的主要原因。下圖為酸、酶法結合提取工藝圖。

1.1酸法提取

該方法主要通過酸性條件破壞膠原分子間的鹽鍵和Schiff鍵（一RC=N-）， 引起膠原纖維的膨脹、溶解，從而達到提取的目的。作為溶劑使用的酸主要有乙酸、檸檬酸、甲酸等。用酸法提取的膠原可以最大限度地保持其三股螺旋結構，適用于生物醫(yī)用材料及其原料。但是酸處理后膠原的溶解量很少。與酶法相比這種方法提取率較低。

1.2酶法提取

酶法具有水解反應快、無環(huán)境污染的優(yōu)點，且提取的水解膠原蛋白純度高、水溶性好、物理化學性質穩(wěn)定。胃蛋白酶還可以催化水解膠原的端肽非螺旋區(qū)，而對螺旋區(qū)無作用，這樣溶解的膠原仍具有完整的三股螺旋結構，更降低了膠原的抗原性，適用于生物醫(yī)用材料及其原料。

1.3鹽法提取

常用于提取膠原的中性鹽有氯化鈉、檸檬酸鹽等。在中性條件下，當鹽的濃度達到一定量時，膠原就會發(fā)生溶解。膠原的溶解和分級受中性鹽效應的影響，影響機理較為復雜。有的鹽可提高膠原的穩(wěn)定性，有的則可降低其構象的穩(wěn)定性，不利于天然膠原的提取。

1.4堿法提取

由于堿容易造成肽鍵的水解，因此得到水解產(chǎn)物的相對分子質量較低。水解過度時，易產(chǎn)生有毒性的D型氨基酸。因此，該方法不適合用于生物醫(yī)用材料膠原蛋白的提取。

2.膠原蛋白的檢測方法

2.1膠原蛋白種類檢測

2.1.1傅里葉紅外光譜檢測法

這種檢測方法是基于反射光源所產(chǎn)生的干涉光與分束器融合，從而使其獲取樣品信息，再利用傅里葉進行轉換處理，形成展現(xiàn)透過率、波數(shù)、吸收度和波長關系的光譜圖，最終明確未知樣品中相關物質的分子組成。有學者通過研究發(fā)現(xiàn)膠原蛋白螺旋結構、氨基酸序列與酰胺三種帶的伸縮振動具有密切相關性。

2.1.2紫外吸收光譜法

膠原蛋白內含的能在紫外吸收光譜中出現(xiàn)吸收峰的不飽和鍵包括：-CO-NH-、-COOH、C6H6 以及多元芳香環(huán)，有學者通過研究提出，大多數(shù)蛋白質在230nm波長下和280nm波長處會出現(xiàn)強吸收峰，但對于只含有微量酪氨酸的膠原蛋白而言，卻只能在波長低于230nm以下才能出現(xiàn)強吸收，因此，可用其對蛋白質中是否含有膠原蛋白進行判定[2]。有學者特以此為依據(jù)，使用多種方法對東方鲀魚皮進行膠原蛋白提取，結果顯示，強吸收峰的出現(xiàn)波長均在235nm左右，同時得出結論，膠原蛋白在利用酶處理后，其紫外吸收能力顯著提高，且結構不會發(fā)生變化。

2.1.3磷酸緩沖鹽溶液和組織化學染色法

磷酸緩沖鹽溶液與膠原蛋白融合后，在溫度低至4℃條件下會以液態(tài)形狀出現(xiàn)，在溫度升高至38℃時會以固態(tài)形狀出現(xiàn)，這也是一種判定是否存在膠原蛋白的方法之一。組織化學染色法又包含天狼猩紅染色法、V.G染色法以及復合染色法。其中V.G染色法只能用來判定是否存在膠原蛋白，天狼猩紅則可對膠原蛋白的種類進行分辨，同時還能測定其含量。而復合染色法可利用膠原蛋白所含的堿性物質與酸性物質發(fā)生強烈反應。

2.2膠原蛋白含量檢測

2.2.1高效液相色譜法

此法主要借助高壓輸液系統(tǒng)將各種溶液置入色譜柱，待相關成分處理完成后使用儀器進行檢測分析。截至目前，已有相關學者將此方法應用于多種原材料中膠原蛋白含量的測定，包括雞皮、蛇皮、鯽魚皮等。

2.2.2紫外分光光度法

紫外分光光度法在檢測過程中首先要對樣品的吸光度進行測評，隨后根據(jù)波長與吸光度完成樣品的吸收譜圖繪制，明確λmax和λmin后，再根據(jù)特定的吸收值判定物質含量。如，測定膠原蛋白含量時，要根據(jù)其吸光度設置曲線圖，在根據(jù)樣品的吸光度及標準曲線的關系測出具體含量。

2.2.3羥脯氨酸比色法

當膠原蛋白處于強酸或強堿狀態(tài)下，遇高溫溶解后會產(chǎn)生羥脯氨酸，隨后以氯胺T氧化羥脯氨酸產(chǎn)生氧化物（內含吡咯環(huán)），清除余下物質后，在特定條件下，此氧化物遇到二甲氨基苯甲醛會產(chǎn)生紅色物質，并可于558nm處檢出，再以標準曲線為依據(jù)將羥脯氨酸濃度進行測定，最終得出膠原蛋白具體含量[3]。

3.結語

隨著社會及科技的不斷發(fā)展，膠原蛋白的應用范圍愈來愈廣。在我國龐大生物資源的支持下，膠原蛋白的提取技術愈發(fā)成熟，從一定程度上提升了國內生物資源的利用率。鑒于膠原蛋白的原材料大部分來源于動物屠宰后的廢棄物，故而，膠原蛋白的提取對環(huán)境改善極為有利。但就目前來看，膠原蛋白的提取與檢測依然存在一些急需解決的弊端，包括新產(chǎn)品的研發(fā)、應用以及膠原蛋白的純化問題等。相信在未來的發(fā)展中，對膠原蛋白的研究會更加深入，對其的提取和檢測方法會愈加先進，膠原蛋白的應用也會愈加廣泛。

參考文獻：

[1]沈曉麗，閆明俞，耿文寧，李海芳.骨膠原蛋白肽粉中DNA的提取及豬、羊源性成分的檢測[J].食品安全質量檢測學報，2020，11（03）：945-949.

[2]林麗，薛為長，麥篤萍，唐蘭英，李明珍.魚皮膠原蛋白的提取與檢測研究綜述[J].內江科技，2019，40（07）：94-95.

[3]盧韻君. 魚源膠原蛋白肽酶解工藝及其分子量檢測方法研究[D].華南理工大學，2016.