APTT糾正試驗結果常用判定方法臨界值建立及診斷效能評價

侯丹鳳，張家紅，宋鑒清

（中國醫科大學附屬第一醫院檢驗科，沈陽 110001）

活化部分凝血活酶時間（activated partial thromboplastin time，APTT）糾正試驗是對不明原因APTT延長的患者進行原因篩查的一線試驗方法，可為指導臨床診斷治療提供重要的參考。當患者血漿和正常混合血漿（normal pooled plasma，NPP）混合后APTT結果被糾正，表明患者血漿中凝血因子不足，因此可進行特異性因子活性測定以確定缺乏的凝血因子。當混合后APTT結果并未被糾正，表明有抑制劑的存在，如狼瘡抗凝物（lupus anticoagulant，LA）或特定的凝血因子抑制物，前者是即刻反應抑制物，后者主要是凝血因子Ⅷ（FⅧ）抑制物，通常依賴于時間和溫度。目前臨床上暫無統一的結果判定方法和臨界值［1］。國內實驗室大部分使用國外小樣本研究所得數據，并未建立更適合國內及本實驗室檢測系統的臨界值，因此，對于結果的解釋有時并不恰當。本研究擬建立4種常用APTT糾正試驗結果判定方法臨界值，并進行效果評價，旨在選擇更適合本實驗室的方法。完整的APTT糾正試驗包括即刻試驗和孵育試驗，本研究僅對即刻試驗進行分析。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 一般資料：回顧性分析2019年3月至2021年10月就診于中國醫科大學附屬第一醫院不明原因APTT延長并進行APTT糾正試驗，且明確APTT延長原因的116例患者的資料。其中，抑制物陽性71例，因子缺乏45例；抑制物陽性包括LA陽性61例，FⅧ抑制物陽性9例，FⅤ抑制物陽性1例；因子缺乏包括vWD2例，FⅫ缺乏10例，FⅪ缺乏3例，FⅨ缺乏4例，FⅧ缺乏13例，FⅤ缺乏2例，FⅡ缺乏1例，同時也收集了使用華法林導致多因子缺乏標本10例。男42例，女74例，中位年齡43.5（1～78）歲。通過凝血因子檢測明確所缺乏凝血因子及其水平，通過稀釋蝰蛇毒凝血時間試驗和硅凝固時間試驗檢測LA，且檢測至少間隔12周，LA陽性≥2次，最終確認為LA陽性標本。通過Bethesda方法檢測凝血因子抑制物。排除使用肝素、直接凝血酶抑制劑的標本。同時排除分析前誤差，如肝素污染、標本送達延遲、EDTA污染、標本凝固、溶血、標本量不足等。

1.1.2 儀器與試劑：應用STA-R EVOLUTION凝血分析儀進行APTT相關所有檢測，所用試劑為STA?-PTT A。試劑1含有兔腦磷脂和硅土（激活物）的凍干粉，試劑2為0.025 mol/L CaCl2。應用ACL TOP-750 凝血分析儀及配套試劑進行LA檢測。

1.1.3 NPP的制備：選取健康體檢者的3.2%枸櫞酸鈉抗凝血20份，男女比例相等，年齡18～55歲，常規凝血試驗結果正常，避免選擇感染、腫瘤、創傷、妊娠、新生兒等人群標本；確保每個單獨血漿標本血小板計數<10×109/L；將收集標本混合后，以1 500g離心15 min2次；排除LA陽性。

1.2 方法

1.2.1 即刻APTT糾正試驗操作方法：將等量的患者血漿與NPP混合后，將患者血漿、NPP和混合后血漿立即裝載至凝血分析儀進行檢測，所得APTT分別為PAPTT、NAPTT、MAPTT。

1.2.2 即刻APTT糾正試驗結果的不同判定方法：（1）目前最常用的方法是循環抗凝劑指數［也稱為羅斯納指數（Rosner index，RI）］，RI（%）=［（MAPTTNAPTT）/PAPTT］×100；（2）百分比糾正法，糾正百分比（%）=［（PAPTT-MAPTT）/（PAPTT-NAPTT）］×100；（3）正常參考范圍法，MAPTT結果不超過APTT正常參考范圍上限，本實驗室建立本地APTT正常參考范圍上限為43 s；（4）差值法，即MAPTT與NAPTT的差值。

1.3 統計學分析

采用SPSS 17.0軟件進行統計學分析，受試者操作特 征（receiver operating characteristic，ROC）曲線評估不同判定方法對APTT糾正試驗結果的診斷效能，即區分因子缺乏和抑制物陽性的能力，同時確定最佳臨界值。比較4種方法設定的最佳臨界值對即刻APTT糾正試驗結果診斷的靈敏度、特異度、陽性預測值和陰性預測值。應用散點圖分析因子缺乏和抑制物陽性標本對不同判定方法所得結果的分布情況。對單因子缺乏標本的因子濃度水平與結果判定方法進行Pearson相關性分析。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 4種判定方法對即刻APTT糾正試驗結果的診斷效能

通過ROC曲線評估4種方法區分凝血因子缺乏和抑制物陽性能力的診斷效能。即刻APTT糾正試驗結果若為糾正，即因子缺乏，反之為不糾正，即抑制物陽性。各判定方法曲線下面積（area under the curve，AUC）見表1。

表1 不同判定方法區分凝血因子缺乏和抑制物陽性的ROC曲線下面積Tab.1 Area under the ROC curve of coagulation factor deficiency and positive inhibitor were distinguished by different methods

2.2 即刻APTT糾正試驗結果不同判定方法的臨界值及評價

通過ROC曲線建立RI法、百分比糾正法及差值法的最佳臨界值分別為12.2%、62%、7.4 s，本實驗室APTT正常參考范圍上限值為43 s，各方法臨界值所對應的靈敏度、特異度、陽性預測值和陰性預測值見表2。

表2 建立不同判定方法的最佳臨界值Tab.2 Establish the optimal cutoff values for different methods

2.3 不同判定方法所得結果的標本分布情況

以不同判定方法的目標參數為縱坐標，導致APTT延長的病因為橫坐標，制作散點圖，分析標本在不同結果判定方法中分布的具體情況。結果如圖1所示，單獨任何一種方法都無法完全區分因子缺乏和抑制物陽性。RI<12.2%基本可識別出因子缺乏標本（圖1A）；糾正百分比>62%可識別出全部因子缺乏標本（圖1B）；差值法設定7.4 s為臨界值時對華法林引起的多因子缺乏識別能力差（圖1C）；所有FⅧ抑制物陽性標本MAPTT均大于正常參考范圍上限43 s（圖1D）。

圖1 4種不同判定方法標本分布情況Fig.1 Specimen distribution of the four different judgment methods

2.4 凝血因子濃度水平和糾正試驗不同結果判定方法的相關性分析

為探討凝血因子水平與不同判定方法所得結果是否有相關性，將單因子缺乏標本（35例）凝血因子水平與RI法、百分比糾正法、差值法、正常參考范圍法結果進行相關性分析。以上相關參數通過Kolmogorov-Smirnov檢驗均服從正態分布，進行Pearson相關性分析。因子濃度與RI法、百分比糾正法、差值法、正常參考范圍法的相關系數r分別為0.536（P<0.01）、-0.710（P<0.01）、0.225（P>0.05）、0.216（P>0.05），因子濃度水平與RI法結果呈中等正相關，與百分比糾正法結果呈顯著負相關，與差值法和正常參考范圍法無相關性。

3 討論

雖然內源性凝血因子缺乏和抑制物陽性（主要是LA陽性）都能使APTT延長，但在臨床上表現為完全不同的癥狀，大部分嚴重的因子缺乏會導致出血，而LA陽性是高凝狀態易形成血栓，在治療上也是采取完全不同的手段。因此，明確無明顯癥狀僅表現為APTT延長的患者的診斷對于治療至關重要，臨床和實驗室標準化協會制定的指南強調對于LA的檢測，篩選、混合和確認試驗都是必要的［2］，遺漏混合試驗會給最終結果帶來假陽性或假陰性［3］。但由于各實驗室使用APTT試劑不同，其成分中的激活劑不同，磷脂的來源、性質和總濃度不同，APTT試劑對肝素、LA和凝血因子缺乏的靈敏度和特異度也大不相同［4-5］。文獻［6］表明，6種不同APTT試劑RI臨界值介于11.5%～15.6%之間。因此，應建立屬于本地實驗室的結果判定值。

本研究對目前的即刻APTT糾正試驗的結果判定方法中常用的4種進行了比較，包括RI法、百分比糾正法、MAPTT與NAPTT差值法和正常參考范圍法，并重新建立了前3種方法的臨界值。但無論哪種方法都無法完全將因子缺乏和抑制物陽性區分開。本研究中RI的臨界值為12.2%，與文獻［7］報道的RI臨界值10%～15%相符。本研究中，百分比糾正法臨界值≥62%，所有因子缺乏標本均被糾正，因此百分比糾正法最大的意義在于<62%可排除因子缺乏。與以往研究［8］結果相同，正常參考范圍法中FⅧ抑制物標本均為部分糾正。雖然FⅧ抑制物是時間溫度依賴的抗體，但高滴度的FⅧ抑制物也可起快速抑制作用［9-10］。從正常參考范圍法散點圖中可發現，無論FⅧ抑制物滴度如何，都不會被糾正至APTT正常范圍內。如血友病等長期因子缺乏患者近期出現出血癥狀或APTT逐漸升高，臨床醫生無法確定是否產生FⅧ抑制物，可通過此方法進行排除。因子抑制物檢測方法昂貴，一般實驗室尚未開展，更無法在資源匱乏的環境中進行基于人群的篩查。本研究結果顯示，只要混合后APTT結果不超過正常參考范圍上限，即可排除FⅧ抑制物的存在，無需進行因子抑制物檢測。當然，這需要擴大樣本量進一步驗證。但這一方法的不足之處在于試劑批號更換時要頻繁驗證參考范圍。差值法沒有將患者APTT結果納入判定結果計算，只考慮NPP和混合后APTT結果，將二者的差值作為判定標準，理論上并不科學。因患者APTT延長的程度一定程度上會影響混合后APTT結果，應將患者APTT也考慮到最終結果計算中，而不是用絕對值作為判定目標值。

本研究發現，因子缺乏程度與RI法結果呈正相關，與百分比糾正法結果呈負相關，即因子缺乏程度越大，結果被糾正的程度越大，因子輕度缺乏的標本被糾正的程度小，甚至不被糾正，與ORELLANA等［11］的研究結果一致。在無法進行因子濃度檢測的實驗室，可根據RI法和百分比糾正法結果大致判斷患者的因子缺乏程度。在各種方法的結果判讀中，總是存在LA陽性標本在糾正試驗中被糾正，這些標本均為LA弱陽性者，在即刻糾正試驗中，低滴度的LA抑制物被稀釋，無法發揮直接抑制作用，而表現出被糾正的假陰性結果［12］。對于使用華法林所致多因子缺乏標本，RI法和百分比糾正法幾乎均可得到標本被糾正的結果，而差值法和正常參考范圍法區分這類標本的能力欠缺。在單因子缺乏引起APTT延長的標本中，最常見的是FⅫ缺乏，FⅫ在內源性途徑的啟動中起關鍵作用，其不足會導致血栓形成，而不會出現其他凝血因子缺乏引起的出血［13］。

綜上所述，每種判定方法都有各自的特點和適用人群，可以嘗試對臨床特定需求使用特定判定方法和臨界值。各方法新建立的臨界值可更好地識別因子缺乏和抑制物陽性的標本，且與其他3種方法相比，RI法用到了所有的APTT結果，使最終判定結果更準確客觀，可最大程度排除各種系統誤差對結果帶來的影響，無論是從判斷因子缺乏還是抑制物陽性都有較好的靈敏性和特異性，且具有最大的AUC，可作為本實驗室APTT糾正試驗結果首要常規判斷方法。本研究的局限性在于研究方法是回顧性分析，無法保證不同人員操作的差異，最終可能給結果帶來的影響也無法評估。由于FⅧ抑制物標本量少，本研究未對孵育試驗的結果進行分析。