茶皂素對蛞蝓體內酶活性的影響

付 莉

(貴州省核桃研究所，貴州 貴陽 550005)

0 引言

【研究意義】蛞蝓(AgriolimaxagrestisLinnaeus)屬軟體動物門腹足綱柄眼目蛞蝓科，俗稱鼻涕蟲，其分布廣泛，發生較普遍，可危害多種農作物[1]。目前，蛞蝓的防治主要以噴灑四聚乙醛等化學農藥為主，長期使用極易使蛞蝓產生抗藥性，影響防治效果。茶皂素(Tea saponin)又稱茶皂苷或茶皂甙，是從山茶科植物種子或種子經榨油后的產物中提取的一種糖甙化合物，屬于五環三萜類，廣泛存在于各種茶類植物中[2]。茶皂素不僅具有溶血、魚毒、消炎和類似植物激素等活性，而且是一種優良的農藥制備助劑，可直接作為生物農藥用于防治有害生物[3-4]。弄清茶皂素對蛞蝓體內酶活性的影響，對蛞蝓的生物防治具有重要意義。【前人研究進展】潘如軍等[5]研究表明，茶皂素對甘薯小象甲(Cylasformicarius)有明顯的取食忌避作用和強烈的拒食作用，且茶皂素能使甘薯小象甲幼體發育歷期縮短，甚至能導致幼體死亡。曾馳等[6]研究表明，30%茶皂素水劑對茶小綠葉蟬(Empoascapirisuga)具有良好的防治效果。王小藝等[7]研究發現，茶皂素對菜青蟲(PierisrapaeL.)3～5齡幼蟲均有強烈的拒食作用。王志高等[8]研究表明，40 mg/L和 50 mg/L茶皂素處理48 h對室內福壽螺的防治效果達100%。【研究切入點】茶皂素作為一種良好的植物源農藥對多種害蟲防效顯著，還可作為殺螺和殺魚的清塘劑，但未見茶皂素對蛞蝓體內酶活性影響的研究報道。【擬解決關鍵問題】探明茶皂素對蛞蝓保護酶和解毒酶活性的影響，以期為蛞蝓的生物防治提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試蟲源 蛞蝓600頭，2021年5月中旬采自貴州省長順縣白菜地，帶回實驗室用遮光培養箱飼養，每天飼喂新鮮小白菜，挑選大小一致的蛞蝓進行后續試驗。按文獻[9]的方法鑒定，其為雙線嗜黏液蛞蝓(Phiolomycusbilineatus)，伸展時體長35～37 mm，體寬6～7 mm，體灰白色，腹足底部肉白色，體背部中央和兩側各有1條黑褐色縱線，生殖孔位于右后觸覺的后側方。

1.1.2 藥劑與試劑盒 83%茶皂素可濕性粉劑，購自杭州中野天然植物科技有限公司；超氧化物歧化酶、過氧化物酶、過氧化氫酶、羧酸酯酶、谷胱甘肽S-轉移酶和乙酰膽堿酯酶試劑盒，均購自南京建成生物工程研究所。

1.1.3 儀器 OCE-Y30型組織研磨器，天根生化科技有限公司；TU-1901型紫外可見分光光度計，北京普析通用儀器有限責任公司；MX-F型漩渦振蕩器，南京東邁科技儀器有限公司；Thermo-17R型高速冷凍離心機，南京以馬內利儀器設備有限公司；W202B型恒溫水浴鍋，上海申勝生物技術有限公司。

1.2 方法

1.2.1 毒力測定 試驗于2021年5月在貴州省林業科學院實驗室進行。茶皂素設5個濃度處理，以等量清水為對照(CK)，共計6個處理。5個濃度茶皂素處理分別為20 mg/mL、10 mg/mL、5 mg/mL、2.5 mg/mL和1.25 mg/mL。采用浸液法將蛞蝓放入CK和各濃度處理的藥液中浸3 s，取出后直接放入培養皿中，每皿中接入大小一致的蛞蝓10頭，每天放入新鮮白菜葉，3次重復，將放入蛞蝓的培養皿進行遮光處理，統計72 h蛞蝓死亡數，采用SPSS 26.0得出毒力方程。

1.2.2 試蟲處理 根據毒力測定結果，以72 h的LC20作為亞致死濃度，處理健康、大小一致的蛞蝓，處理時間設6 h(處理1)、12 h(處理2)、24 h(處理3)、48 h(處理4)和72 h(處理5)5個處理, 均以等量清水相同處理時間為對照(CK)。處理完成后取健壯、活潑的幼蟲，冰箱中-80℃保存，用于酶活性測定。

1.2.3 酶活性測定 超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化物酶(POD)、過氧化氫酶(CAT)、羧酸酯酶(CarE)、谷胱甘肽S-轉移酶(GSTs)、乙酰膽堿酯酶(AchE)酶液的制備及活性測定方法參照各試劑盒說明，采用分光光度法測定。

1.3 數據處理

采用SPSS 26.0對數據進行統計分析，處理間差異采用單因素方差分析，用LSD方法進行差異顯著性檢驗。

2 結果與分析

2.1 茶皂素對蛞蝓的毒力

試驗結果表明，茶皂素對蛞蝓的毒力方程為y=2.949x-2.934，R為0.975；亞致死濃度(LC20)為5.123 mg/mL，95%置信區間為2.722～7.355；致死中濃度(LC50)為9.883 mg/mL，95%置信區間為6.805～14.480，說明茶皂素對蛞蝓具有較高的浸殺活性。

2.2 茶皂素不同時間處理蛞蝓保護酶的活性

從表1看出，茶皂素亞致死濃度(LC20)不同時間處理蛞蝓幼蟲體內超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化物酶(POD)和過氧化氫酶(CAT)等保護酶活性具有激活和抑制作用。SOD：不同時間處理及同期CK分別為1.31～2.43 U/mg和2.97～3.35 U/mg，不同時間處理酶活性均低于CK，各處理較CK降低18.46%～56.04%，除處理4與CK間差異顯著外，其余時間處理與CK間差異極顯著，表明不同時間處理對SOD活性均具有抑制作用。POD：不同時間處理及同期CK分別為3.87～4.58 U/mg和3.82～5.36 U/mg，除處理1與CK間差異極顯著外，其余時間處理與CK間差異均不顯著；其中，處理2和處理4較CK分別升高1.33%和8.12%，處理1、處理3和處理5較CK分別降低27.80%、4.09%和13.79%，表明處理2和處理4對POD活性具有激活作用，處理1、處理3和處理5對POD活性具有抑制作用。CAT：不同時間處理及同期CK分別為15.99～28.33 U/mg和20.28～27.28 U/mg，各處理與CK間均差異極顯著，處理1和處理2較CK分別升高29.66%和9.80%；處理3、處理4和處理5較CK分別降低12.18%、41.39%和30.70%，表明處理1和處理2對CAT活性具有激活作用，處理3～5對CAT活性具有抑制作用。

表1 茶皂素亞致死濃度(LC20)不同時間處理蛞蝓保護酶的活性

2.3 茶皂素不同時間處理蛞蝓解毒酶的活性

從表2可知，茶皂素亞致死濃度(LC20)不同時間處理蛞蝓幼蟲體內羧酸酯酶(CarE)、乙酰膽堿酯酶(AchE)和谷胱甘肽S-轉移酶(GSTs)等解毒酶活性均具有抑制作用。CarE：不同時間處理及同期CK分別為4.57～5.97 U/mg和5.45～6.16 U/mg，各處理較CK降低3.08%～23.06%，除處理2和處理4與CK間差異極顯著外，其余處理與CK間差異均不顯著。AchE：不同時間處理及同期CK分別為0.44～0.58 U/mg和0.59～0.65 U/mg，各處理較CK降低6.45%～31.25%，各處理與CK間差異極顯著。GSTs：不同時間處理及同期CK分別為39.00～56.74 U/mg和51.06～65.61 U/mg，各處理較CK降低13.52%～29.43%，各處理與CK間差異極顯著。

表2 茶皂素亞致死濃度(LC20)不同時間處理蛞蝓解毒酶的活性

3 討論

超氧化物歧化酶、過氧化物酶和過氧化氫酶統稱為保護酶系統[10]，在3種酶的共同作用下，細胞內的自由基維持在一個較低水平，從而防止自由基毒害。吳德東等[11]報道，舞毒蛾(Lymantriadispar)幼蟲經北烏頭乙酸乙酯萃取物亞致死濃度(LC20)處理后，超氧化物歧化酶、過氧化氫酶和過氧化物酶活性均為先激活后抑制。何發林等[12]研究表明，溴氰蟲酰胺亞致死劑量初期可誘導小地老虎(Agrotisipsilon)體內過氧化物酶、過氧化氫酶和超氧化物歧化酶活性升高。研究結果表明，茶皂素亞致死濃度(LC20)對蛞蝓體內SOD活性表現為抑制作用，對POD活性表現為抑制-激活-抑制-激活-抑制作用，對CAT活性表現為先激活后抑制作用。

羧酸酯酶、乙酰膽堿酯酶和谷胱甘肽S-轉移酶在分解外源毒物、維持正常生理代謝方面起著重要作用[13]。張振威等[14]研究發現，舞毒蛾2齡幼蟲體內AchE活性在甲維鹽的作用下均明顯受到抑制，處理 24 h 后GSTs 活性被激活。白桂芬等[15]研究表明，多菌靈對蚯蚓(Earthworm)體內的乙酰膽堿酯酶整體具有抑制作用，對谷胱甘肽S-轉移酶整體具有激活作用，對羧酸酯酶活性在低濃度時具有誘導激活作用，高濃度時具有抑制作用。張文領等[16]報道，福壽螺螺(Pomaceacanaliculata)在四聚乙醛亞致死濃度脅迫下，乙酰膽堿酯酶活性在福壽螺鰓和腹足內呈先升后降趨勢，肝臟和腸內活性呈先降后升趨勢。鰓、腸和腹足內GSTs活性均呈先降后升再降趨勢。研究結果表明，茶皂素亞致死濃度(LC20)處理后，蛞蝓體內羧酸酯酶、乙酰膽堿酯酶和谷胱甘肽S-轉移酶活性均不同程度受到抑制，且谷胱甘肽S-轉移酶隨處理時間延長，其抑制作用增大。

4 結論

茶皂素對蛞蝓具有較高的浸殺活性，72 h的亞致死濃度(LC20)為5.123 mg/mL，可有效干擾蛞蝓體內SOD、POD、CAT、CarE、AchE和GSTs的活性，擾亂其正常生理代謝功能。