黃連解毒湯對阿爾茨海默病小鼠閉鎖小帶蛋白表達的影響

呂翰林，張英華，樊麗，周建文，李洋*

（1.齊齊哈爾醫學院附屬第一醫院，黑龍江 齊齊哈爾 161041；2.齊齊哈爾醫學院精神衛生學院，黑龍江 齊齊哈爾 161006；3.齊齊哈爾醫學院醫藥科學研究院，黑龍江 齊齊哈爾 161006）

0 引言

阿爾茨海默病（Alzheimer's disease，AD）是一種隨著年齡增加，不斷發展的神經退行性疾病[1]。縱觀世界人口老齡化的不斷增加，有效的預防和治療AD的發生發展就顯得尤為重要。近年來，有研究學者發現，β-淀粉樣蛋白（Aβ）沉積是導致AD疾病發生的關鍵因素之一[2]，也有學者認為，當腦血管功能發生障礙時，Aβ沉積，無法通過血腦屏障（blood brain barrier，BBB）[3]，而BBB的重要結構為血管內皮細胞緊密連接，閉鎖小帶蛋白（ZO-1）是其重要成分[4]，上調ZO-1的表達，可能是降低Aβ沉積，改善AD的有效方法。祖國醫藥黃連解毒湯出自《肘后備急方》[5]，對腦血管內皮細胞具有保護作用，因此本實驗通過檢測黃連解毒湯對APP/PS1雙轉基因小鼠Aβ和ZO-1表達的影響，探討對AD的保護機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物

5月齡清潔級APP/PS1雙轉基因小鼠，40只，C57BL/6小鼠，8只，購自南京生物醫藥研究院（SCXK（蘇）2015-0001）。將小鼠分為6組：正常組、模型組、多奈哌齊組、黃連解毒湯低、中、高組，動物均飼養于齊齊哈爾醫學院動物實驗中心。

1.1.2 藥物制備及分組給藥

黃連解毒湯由黃連9g、黃芩6g、黃柏6g、梔子9g組成，齊齊哈爾醫學院醫藥科學研究院制備成低、中和高劑量（1.5、3、6）g·kg-1·d-1。正常組和模型組給予生理鹽水2mg·kg-1·d-1，多奈哌齊組給予0.001g·kg-1·d-1，連續灌胃45d。

1.1.3 儀器和試劑

ABI熒光定量PCR儀（美國Thermo，Q5），多功能酶標儀（奧地利Tecan，Spark），ZO-1（武漢博士德生物有限公司，PB9234）。

1.2 方法

1.2.1 Morris水迷宮檢測

圓形水池中加入奶粉作為背景，訓練4d，每次60s。第5d撤去平臺，記錄小鼠穿越平臺的次數，以及目標象限游程。

1.2.2 Western blot 檢測

加裂解液將小鼠海馬組織溶解，蛋白定量。電泳、電轉、封閉、一抗Aβ（1:1000）、ZO-1（1:500）和β-actin（1:1000），4℃過夜，二抗，洗膜后顯色，分析統計灰度值。

1.2.3 實時熒光定量PCR檢測

Trizol提總RNA，反轉錄cDNA，設計特異性引物，Aβ(F:5'-ATCGTGATTCCTTACCGTTGC-3'；R:3'-CTCTTCTCGCTGCATGTCTC-5')；ZO-1(F:5'-GCCGCTAAGAGCACAGCAA-3'，R:3'-GCCCTCCTTTTAACACATCAGA-5')；GAPDH(F:5'-GAGACCTTCAACACCCCAGC-3'，R:3'-CCACAGGATTCCATACCCAA-5')，加入熒光材料SYBR Green I，實時監測得到數據，采用2-ΔΔCt法計算分析數據。

1.3 觀察指標

1.3.1 穿越平臺次數和目標象限游泳距離

穿越平臺次數的多少是評價學習保持能力的重要指標；目標象限游程評價記憶能力的改善。

1.3.2 Aβ和ZO-1蛋白的表達

判斷APP/PS1小鼠學習記憶的改善可通過檢測Aβ和ZO-1蛋白的表達實現，觀察其相關性。

1.3.3 Aβ和ZO-1 mRNA的表達

Aβ和ZO-1 mRNA的表達為了檢測基因水平的變化，判斷是否通過調控基因水平，改善小鼠的記憶功能。

1.4 統計學分析

2 結果

2.1 水迷宮結果

2.1.1 HLJDT對APP/PS1雙轉基因小鼠學習記憶能力的影響

與正常組比較，模型組小鼠穿越平臺次數和目標象限游程均減少（P<0.05）；與模型組比較，多奈哌齊組和HLJDT高劑量組小鼠穿越平臺次數和目標象限游程均增加（P<0.05），HLJDT低、中劑量組無明顯差異（P>0.05），見表1。

表1 HLJDT對APP/PS1雙轉基因小鼠學習記憶能力的影響（，n=8）

表1 HLJDT對APP/PS1雙轉基因小鼠學習記憶能力的影響（，n=8）

注：與正常組比較，1)P<0.05；與模型組比較，2)P<0.05，3)P>0.05

2.2 HLJDT對APP/PS1雙轉基因小鼠海馬區Aβ和ZO-1蛋白表達的影響

與正常組比較，模型組小鼠海馬區Aβ蛋白表達升高（P<0.05），ZO-1蛋白表達降低（P<0.05）；與模型組比較，多奈哌齊組和HLJDT高劑量組小鼠海馬區Aβ蛋白表達降低（P<0.05），ZO-1蛋白表達升高（P<0.05），HLJDT低、中劑量組Aβ和ZO-1蛋白表達無明顯差異（P>0.05），見表2、圖1。

圖1 Western blot 檢測Aβ和ZO-1蛋白在各組小鼠腦海馬區表達水平

表2 HLJDT對APP/PS1雙轉基因小鼠海馬Aβ和ZO-1蛋白表達的影響（，n=8）

表2 HLJDT對APP/PS1雙轉基因小鼠海馬Aβ和ZO-1蛋白表達的影響（，n=8）

注：與正常組比較，1)P<0.05；與模型組比較，2)P<0.05，3)P>0.05

2.3 HLJDT對APP/PS1雙轉基因小鼠海馬區Aβ和ZO-1 m RNA表達的影響

與正常組比較，模型組小鼠海馬區Aβ mRNA表達升高（P<0.05），ZO-1 mRNA表達降低（P<0.05）；與模型組比較，多奈哌齊組和HLJDT高劑量組小鼠海馬區Aβ mRNA表達降低（P<0.05），ZO-1 mRNA表達升高（P<0.05），HLJDT低、中劑量組Aβ和ZO-1 mRNA表達無明顯差異（P>0.05），見表3。

表3 HLJDT對APP/PS1雙轉基因小鼠海馬Aβ和ZO-1 mRNA表達的影響（，n=8）

表3 HLJDT對APP/PS1雙轉基因小鼠海馬Aβ和ZO-1 mRNA表達的影響（，n=8）

注：與正常組比較，1)P<0.05；與模型組比較，2)P<0.05，3)P>0.05

3 討論

隨著人口老齡化逐年增長，越來越多的老年人患AD疾病。預防和治療AD也成為當今研究的熱點話題。目前治療AD的藥物大多都只能緩解癥狀，不能根治，同時還伴有一定的副作用。而祖國醫藥，能從多方向入手，多靶點進行疾病的治療，適合AD疾病多因素發展的特點。黃連解毒湯由黃連、黃芩、黃柏、梔子4味藥組成，多藥合用，具有補氣血，清熱解毒的功效[6]，正適用于本虛標實的AD疾病，在前期研究結果[7]中也有所體現。

研究學者提出神經血管假說[8]，假說認為AD復雜的病理過程，是由神經血管改變引起的，血腦屏障清除Aβ異常，導致Aβ沉積，最終引起AD疾病的發生[9]。閉鎖小帶蛋白（ZO-1）是維持血腦屏障完整性的重要結構[10]，研究表明，上調ZO-1，可以減輕血腦屏障的破壞，Aβ沉積減少，改善AD癥狀[11]。因此，上調ZO-1表達，降低Aβ表達，可能是治療AD的有效方法。本實驗結果說明HLJDT可改善AD小鼠的學習記憶能力，HLJDT高劑量組更為有效。HLJDT可通過升高ZO-1表達，抑制Aβ表達，保護血腦屏障完整性，從而發揮對AD的保護作用。