4種中藥單體對抗原提呈細胞免疫激活作用的研究

路冉 王爽 王斌

(青島大學基礎醫學院，山東 青島 266071)

先天性免疫系統在機體受到病原體感染時會快速啟動，并產生炎癥反應，同時激活適應性免疫系統，這是保護機體的第一道重要免疫防線[1]。先天免疫細胞還可以通過靶向激活受體或者通過阻斷抑制通路，或者與適應性免疫的相互作用來實現抗腫瘤功能[2]。鑒于先天免疫的重要性，關于如何激活先天免疫，以及尋找新的抗原提呈細胞(APCs)的激活劑成為抗腫瘤相關研究的熱點[3-4]。黃酮類是一類具有C6-C3-C6結構的天然多酚類化合物，且具有多種生物活性，如抗腫瘤、抗炎、抗氧化、防治神經紊亂以及免疫調節等作用[5-6]；而且由于其毒副作用小、易獲取等特點[7]，具有作為疫苗佐劑的條件和潛力，因此也是目前佐劑研究的熱點。研究發現，黃酮類化合物白楊素、蔓荊子黃素、刺芒柄花素和北美圣草素均具有免疫調節作用[8-10]，但關于這4種中藥單體激活APCs的能力的相關研究目前報道較少，因此本研究旨在通過檢測這4種中藥單體在細胞水平上對APCs的激活作用，以篩選出具有免疫激活作用的中藥單體，為腫瘤相關疫苗佐劑研發提供數據參考。

1 材料與方法

1.1 細胞、儀器與試劑

白楊素(純度≥98%)、蔓荊子黃素(純度≥98%)、刺芒柄花素(純度≥98%)和北美圣草素(純度≥98%)均購自大連美侖生物科技有限公司；流式抗體PE anti-mouse CD80、PE anti-mouse CD86、PE anti-mouse主要組織相容性復合體Ⅰ(MHCⅠ)及PE anti-mouse I-A/I-E均購自美國Biolegend公司；小鼠單核巨噬細胞RAW264.7細胞系購自中國科學院上海細胞資源中心；小鼠骨髓來源樹突狀細胞DC2.4細胞系由本實驗室保存。

1.2 細胞培養

RAW264.7細胞和DC2.4細胞分別接種于含體積分數0.10胎牛血清的DMEM培養基中，置于37 ℃、含體積分數0.05的CO2培養箱中傳代培養，待細胞培養2～3代狀態穩定后，用于后續實驗。

1.3 藥物的溶解和配制

蔓荊子黃素、刺芒柄花素和北美圣草素分別以二甲基亞砜進行溶解，制備成濃度為20、25、40 g/L的母液，白楊素以乙醇進行溶解，制備成濃度4 g/L的母液。將每種中藥單體的母液再以含體積分數為0.10胎牛血清的DMEM培養基進行稀釋，分別配制成低、中、高3個濃度，白楊素的終濃度為10、20、40 mg/L，蔓荊子黃素為0.1、1、10 mg/L，刺芒柄花素為0.25、2.5、25 mg/L，北美圣草素則為0.4、4、40 mg/L。將脂多糖(LPS)溶解于含體積分數0.10胎牛血清的DMEM培養基當中，并配制成終濃度為6 mg/L。

1.4 細胞的分組和免疫刺激活性的檢測

將傳代后的RAW264.7細胞和DC2.4細胞分別接種于96孔板中，置于37 ℃、含體積分數0.05的CO2培養箱中培養12 h，待細胞貼壁穩定，處于旺盛生長期，細胞形態正常，融合度為60%～70%時，棄掉96孔板中原培養基。每孔細胞中分別加入上述配制好的不同濃度的4種中藥單體，分別為蔓荊子黃素組、刺芒柄花素組、北美圣草素組和白楊素組，再根據濃度不同分為低、中、高3個亞組，同時每組藥物再分別設置陰性對照亞組和陽性對照亞組；其中陰性對照亞組為每孔細胞中分別加入含體積分數0.10胎牛血清的DMEM培養基100 μL，陽性對照亞組為每孔細胞中分別加入濃度為6 mg/L的LPS溶液100 μL。然后均置于37 ℃、含體積分數0.05的CO2培養箱中共同孵育48 h[11]以后，分別向RAW264.7細胞以及DC2.4細胞中加入PE anti-mouse CD80、PE anti-mouse CD86、PE anti-mouse MHCⅠ和PE anti-mouse I-A/I-E 4種抗體，在4 ℃無血清DMEM培養基中避光孵育30 min后，用Beckman CytoFLEX流式細胞儀檢測2種細胞表面CD80、CD86、MHCⅠ和MHCⅡ的表達情況。每組細胞設置3個復孔，結果取均值。

1.5 統計學分析

2 結 果

2.1 4種中藥單體對RAW264.7細胞的免疫激活作用比較

兩因素析因設計方差分析結果顯示，藥物、濃度以及藥物與濃度交互作用均對RAW264.7細胞中CD80、CD86、MHCⅠ和MHCⅡ4種表面標志物的表達具有顯著影響(F藥物=19.44～168.97，F濃度=4.74～2 715.65，F藥物*濃度=4.37～196.42，P<0.05)。單獨效應分析結果顯示，4種中藥單體的高濃度亞組間RAW264.7細胞中4種表面標志物表達水平比較差異均有顯著性(F=5.40～44.18，P<0.05)，低濃度和中濃度亞組間，4種表面標志物的表達水平比較差異均無顯著性(P>0.05)。另外，白楊素組的各亞組間RAW264.7細胞之中CD80、CD86、MHCⅠ和MHCⅡ表達水平比較差異均有顯著性(F=17.54～51.54，P<0.05)；蔓荊子黃素組和刺芒柄花素組的各亞組間RAW264.7細胞之中CD80、CD86、MHCⅠ表達水平比較差異有顯著性(F=38.02～1 543.14，P<0.05)，但MHCⅡ的表達水平比較差異無顯著性(P>0.05)；北美圣草素組的各亞組間RAW264.7細胞中CD80和CD86表達水平比較差異均具有顯著性(F=331.91、1 543.14，P<0.05)，但MHCⅠ和MHCⅡ的表達水平比較差異無顯著性(P>0.05)。見表1。

表1 4種中藥單體對RAW264.7細胞的免疫激活作用比較

2.2 4種中藥單體對DC2.4細胞的免疫激活作用比較

析因設計方差分析結果顯示，藥物、濃度以及藥物與濃度交互作用均對DC2.4細胞中CD80、CD86、MHCⅠ和MHCⅡ4種表面標志物表達有顯著的影響(F藥物=25.52～68.43，F濃度=37.62～300.95，F藥物*濃度=15.26～77.89，P<0.05)。單獨效應分析結果顯示，4種中藥單體的中、高濃度亞組間DC2.4細胞中4種表面標志物表達水平比較差異均有顯著性(F=3.82～170.14，P<0.05)，低濃度亞組DC2.4細胞中CD80、CD86和MHCⅠ表達水平比較差異均有顯著性(F=3.86～10.80，P<0.05)，但MHCⅡ的表達水平比較差異無顯著性(P>0.05)。另外，白楊素組和北美圣草素組各亞組間DC2.4細胞中4種表面標志物表達水平比較差異均具有顯著性(F=3.89～144.44，P<0.05)；蔓荊子黃素組和刺芒柄花素組的各亞組間DC2.4細胞中CD80、CD86、MHCⅡ表達水平比較差異有顯著性(F=34.52～240.18，P<0.05)，但MHCⅠ的表達水平差異無顯著性(P>0.05)。見表2。

表2 4種中藥單體對DC2.4細胞的免疫激活作用比較

3 討 論

疫苗佐劑是指摻入疫苗中以增強免疫原性的化合物，可提高高度純化的疫苗抗原的免疫原性，增強疫苗的效力，且不影響疫苗安全性[12-13]。疫苗佐劑的作用方式包括抗原的緩釋、免疫細胞的募集、炎癥小體的激活、MHC分子增強抗原提呈以及免疫調節[14]。疫苗添加佐劑的優勢在于可以節省疫苗劑量，并能更加快速、廣泛和強力地誘導免疫反應[15]。目前為止，獲得許可的人類疫苗中使用的佐劑和僅在實驗室或臨床試驗中進行研究的佐劑都有引起全身或局部不良反應的可能，因此，疫苗佐劑的開發和研制具有重要的臨床意義[16-20]。激活機體的先天性免疫機制，是目前研發更安全有效的新一代疫苗佐劑的新方向[21]。

研究顯示，先天免疫在抗腫瘤等方面發揮著至關重要的作用。在腫瘤免疫防御和監測中，自然殺傷細胞作為先天免疫細胞可以充分發揮其細胞毒性作用直接殺傷腫瘤細胞，巨噬細胞的吞噬功能在針對某些腫瘤的免疫防御中也有一定作用。另外先天免疫細胞在抗體誘導后也可以發揮效應功能，例如依賴于Fc受體表達的抗體依賴性細胞毒作用。因此，先天免疫細胞在腫瘤進展中起著重要的防御和調節作用[22]。此外，針對抗腫瘤的有效免疫反應通常涉及先天免疫系統和適應性免疫系統細胞之間的相互協調[23]，如可通過APCs在腫瘤條件下激活腫瘤抗原特異性CD8+T細胞功能來實現[24]。APCs對腫瘤抗原的攝取導致交叉呈遞——MHCⅠ分子呈遞外源性抗原，從而誘導腫瘤特異性CD8+T細胞的啟動和該細胞群體的增殖[25]。

中藥提取物可通過不同途徑作用于先天免疫和適應性免疫系統，其中黃芪多糖等這些傳統補益類藥物中的多糖，調節免疫功能的作用較為突出，可通過增加樹突狀細胞等APCs的數量，或促進其表面細胞因子的表達，加強抗原提呈能力，增強機體免疫[26-27]。黃酮類中藥單體對機體的細胞免疫和體液免疫功能也具有調節作用，主要類型有二氫黃酮、二氫黃酮醇、黃酮、黃酮醇、花色素、異黃酮等。

本研究通過探討白楊素、蔓荊子黃素、刺芒柄花素和北美圣草素4種中藥單體在體外對巨噬細胞和樹突狀細胞分子表達的調控，用流式細胞儀檢測藥物誘導先天免疫細胞活化的能力，篩選出對APCs免疫激活潛能最強的中藥單體。結果顯示，白楊素組的各亞組之間RAW264.7和DC2.4細胞表面的CD80、CD86、MHCⅠ和MHCⅡ表達水平比較差異均有顯著性；蔓荊子黃素組和刺芒柄花素組的各亞組間RAW264.7細胞中CD80、CD86和MHCⅠ的表達水平比較差異有顯著性，DC2.4細胞中CD80、CD86和MHCⅡ的表達水平比較差異有顯著性；北美圣草素組的各亞組間RAW264.7細胞和DC2.4細胞中CD80和CD86的表達水平比較差異有顯著性，DC2.4細胞的MHCⅠ和MHCⅡ表達水平比較差異有顯著性。在低濃度的4種中藥單體刺激下，各藥物間DC2.4細胞中CD80、CD86和MHCⅠ表面標志物表達水平比較差異有顯著性，RAW264.7細胞中4種表面標志物表達水平比較差異無顯著意義；在中濃度的4種中藥單體刺激下，各藥物間DC2.4細胞中4種表面標志物表達水平比較差異有顯著性，RAW264.7細胞中4種表面標志物表達水平比較差異無顯著性；在高濃度的4種中藥單體刺激下，各藥物間RAW264.7和DC2.4細胞中CD80、CD86、MHCⅠ和MHCⅡ表達水平比較差異均有顯著性，其中白楊素在高濃度時刺激RAW264.7和DC2.4細胞中4種表面標志物表達水平最高。由此可以提示，高濃度時4種中藥單體均對RAW264.7和DC2.4細胞具有免疫激活作用，白楊素免疫的激活能力最強，蔓荊子黃素和刺芒柄花素次之，北美圣草素最弱。

研究顯示，APCs攝取和加工抗原后，將抗原以抗原肽-MHCⅡ類分子復合物的形式表達在細胞膜上并提呈給CD4+T細胞。MHC分子由一組不同的多態基因編碼[28]，MHC分子首先與T細胞受體相結合，然后將抗原呈遞給T細胞受體，提供初始T細胞活化的啟動信號(第一信號)，同時還能夠以抗原肽-MHCⅠ類分子復合物的形式將抗原肽提呈給CD8+T細胞并將其激活。另外APCs高表達CD80、CD86等共刺激分子，從而為T細胞充分活化提供了第二信號[29]。APCs分泌的細胞因子進一步誘導活化T細胞增殖和分化，從而啟動免疫應答。本研究中，白楊素在體外刺激RAW264.7和DC2.4細胞的MHCⅠ和MHCⅡ分子的表達水平升高，增強了初始T細胞活化的起始信號(第一信號)；同時刺激RAW264.7和DC2.4細胞表面的共刺激分子CD80和CD86表達水平的升高，增強了T細胞活化的第二信號。因此，白楊素具有激活先天免疫，進而啟動適應性免疫以及發揮抗腫瘤作用的潛力。目前，開發疫苗佐劑的重點是，找到一種能夠保證其安全性且定義明確的化合物，它們應具有激活先天免疫反應并且增強或改變疫苗誘導的免疫應答的能力[30-31]。研究結果顯示，白楊素作為一種黃酮類化合物，其安全性較高，而且定義明確、結構簡單[32-33]，體外激活APCs的能力也較強，具有做為疫苗佐劑的潛力，但后續還需要進一步的體內試驗進行驗證。

綜上所述，白楊素對APCs具有免疫激活作用，其中高濃度的白楊素對APCs的免疫激活潛能最強，未來有望作為一種候選藥物在抗腫瘤治療和疫苗佐劑研發等領域發揮作用。